干细胞分离及培养

1.1实验材料
1.1.1 实验标本与分组
1）实验标本:12例骨科外伤手术健康志愿者（排除血液系统疾病、结核及肿瘤浸润性疾病）,其中女性5名，男性7名，16岁～65岁。

在手术室行髂骨取骨术时无菌状态下抽取髂骨骨髓2～3ml/人。

2）分组:12例标本，按年龄分组如下
①A组：16岁～25岁，n＝6；
②B组：50岁～65岁，n＝6。

1.2 实验方法
1.2.1 人骨髓的获得与hBMSCs的分离
无菌环境下从我院12名骨外科手术志愿患者（排除血液系统疾病，结核及肿瘤浸润疾病）中采用20ml一次性注射器，肝素化后抽取骨髓2～3ml，放入已消毒好的盛有5ml L-DMEM的试管（先肝素化）内，无菌容器盛装试管送回实验室。

将骨髓与L-DMEM混匀，1500rpm×5min去除上层脂肪滴及上清，以D-Hank’s 液重新悬浮细胞后将其悬液平铺于淋巴细胞分离液上（Percoll 1.073g/ml，Sigma），1500rpm×10min，吸取中间层的白膜层（单核细胞层），D-Hank，s液洗涤2次，1500rpm×5min，弃去上清，L-DMEM重新打匀。

灭菌的0.17mol/L的饱和NH4CL溶液按1：5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保存10min,取出后1000rpm×5min，弃去上清，D-Hank，s液洗涤2次，L-DMEM重悬后，按2.0×106/ml浓度接种。

1.2.2 hBMSCs的原代培养
将经上述分离步骤所获得的有核骨髓细胞加入含有10％NBCs的L-DMEM中，按2.0×106/ml的细胞浓度接种于50ml的一次性塑料培养瓶内。

静置于37℃，5％CO2的CO2培养箱内培养。

接种后的第48hr进行第1次半换液，换液前轻轻摇晃，使未贴壁细胞悬浮，弃倒掉一半培养液，可将未贴壁的细胞部分弃掉（避免不能贴壁的细胞占用培养瓶空间，使能贴壁细胞不能贴壁），重新换入含有10％NBCs的L-DMEM；间隔2d后再次半换液1次以清除未贴壁细胞。

两次半换液后，细胞隔日洗涤、全换液，使细胞逐渐纯化。

1.2.3 hBMSCs的传代培养
当原代细胞铺满培养瓶的底面80%～90%时，倒净原培养液，用0.01M PBS（PH7.2）洗涤2次。

加入37℃，0.5ml的0.25％Trypsin溶液，轻轻旋转，使瓶底细胞全部浸入该溶液中。

倒置显微镜下观察细胞变化。

随着时间的推移，原贴壁的呈纤维状的细胞逐渐趋于圆形，在细胞还未漂起时将溶液弃去，立即加入10ml 含10％NBCs的L-DMEM终止消化。

也可以用肉眼观察消化，当见到培养瓶底发白，出现细针孔样空隙时即可终止消化。

在室温下，消化时间约为1～2min。

用吸管将贴壁的细胞轻柔吹打成悬液，调整细胞浓度为1.0×105/ml后，按1∶3的比例传代,分到3个50ml的培养瓶中，置37℃,5%CO2的CO2培养箱内继续培养。

观察细胞贴壁生长情况。

每2d换液1次,培养液为含10%NBCs的L-DMEM,观察细胞的生长情况,待细胞基本融合,再用0.25％Trypsin溶液消化,以上述方法进行传代扩增培养。