实验五 转基因植物的RT-PCR检测

实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。
实验步骤
2、cDNA第一链的合成：
取 1 个 0.2ml 的 PCR 管，依次加入下列试剂： 10×PCR Buffer 1 μl RNase Free dH2O 5.75 μl dNTP 1 μl RNase Inhibitor 0.25 μl AMV RTase Transcriptase 0.5 μl oligo dT-Adaptor primer 0.5 μl RNA 1μl Total 10μl





溶菌酶的作用作用?沸水加热的作用? 利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁,加热 可使蛋白质和染色体DNA变性. 将实验电泳结果粘到实验报告上，并对结果 分析。 比较三种提取 方法的区别？
利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的 电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验报告
1、将实验结果粘到实验报告上。 2、 如何选择RT-PCR的反转录引物。 3、结合实验结果，试论应用RT-PCR研究 外源基因转录表达的优缺点。
实验目的
1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外源 基因表达调控进行研究，掌握引物的选择、 cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。 。
实验材料、设备及试剂
1、材料： 转基因植物的RNA或mRNA制备物。 非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物 2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。 3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物 （随机引物，Oligo dT; 特异引物)、 10×One Step RNA PCR Buffer、25 mM MgCl2、10 mM dNTP、RNase Inhibitor (40 U/μl)、AMVOptimized Taq1 μl、AMV RTase XL (5 U/μl)、 上游特异Primer (20 μM)*1、下游特异Primer (20 μM)*2、RNase Free H2O。
反应条件：
42 ℃ 30min 99 ℃ 5minBiblioteka Baidu5 ℃ 5min
3、PCR反应
取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂： 10×PCR Buffer 4 μl 灭菌蒸馏水 9μl 10 mM dNTP ２.5 μl Taq酶 0.1 μl 上游特异Primer (20 μM)*1 0.2 μl 下游特异Primer (20 μM)*2 0.2μl Total 16 μl 将（1）的反应结果稀释20倍，取10 μl 加入到（2）管中， 轻轻摇匀。
反应条件：
94℃ 2min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 1min 72 ℃ 7min
30Cycles
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法 1、RT-PCR (RNA)
2、Northern blot (RNA) 3、real-time PCR (RNA ）
结果与分析

实验一、质粒三种提取方法的比较
为什么要用对数期的菌液提取质粒 ？ 因为对数期菌的 生长状况和数量最佳,有利于提取质粒 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？ 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响， 并且可以在后续步骤中被除去 溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷 基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也 沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀