细菌分离培养及鉴定

显微镜下的杆菌
革兰染色注意事项
标本涂片不宜太厚 固定不宜过热 脱色不宜过度 选用培养18--24小时菌龄的细菌为宜
抗酸染色
原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中
主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染 色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性 乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红 的颜色,达到染色目的。
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰
焰芯
细菌接种的基本程序
灭菌接种环 杀灭接种环沾染的细菌，以免污染标本
沾取标本
接种
灭菌接种环
杀灭接种环沾染的细菌，以免污染环境
细菌接种法
平板划线接种法： ★目的：使混合的细菌呈单个分散生长， 形成单个菌落，以便获得纯菌。 ★方法： 分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本 液体培养基接种法 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 斜面接种法 倾注培养法:用于细菌计数
分级 A B 白细胞（个） >25 >25 上皮细胞（个） <10 <25
C
<10
>25
A、B两种情况的痰适合做培养，C不合格，应重新留标本
常用的培养基种类和用途
哥伦比亚血平板—营养要求高的细菌 巧克力平板—含V、X因子，主要培养嗜血杆菌、脑 膜炎球菌和淋球菌用 中国蓝/麦康凯平板—G-杆菌用 SS平板—沙门氏菌和志贺氏菌用 M-H平板—细菌药敏用 TCBS平板—弧菌科细菌用 沙包氏平板—真菌培养用 真菌显色平板—真菌培养用 罗氏培养基—分枝杆菌用
成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌 由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密， 故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小 ，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，， 因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈 紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含 量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类 脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻 挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍 呈无色，再经复红等红色染料复染，就使革兰氏阴性 菌呈红色。
★
★
分区划线法(3区)
第一区划线 灭菌接种环 第二区划线 灭菌接种环 第三区划线 灭菌接种环
连续划线法
细菌培养法
一般培养（需氧培养）： ★培养温度：35℃（采用恒温培养箱） ★培养时间：18～24h 二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养 箱 厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧 罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等
细菌的初步分类
触酶试验
主要用于G+球菌的分类。葡萄球 菌属（微球菌属）：触酶（+），链球菌属及 肠球菌：触酶（-） 氧化发酵试验（O/F试验） 根据细菌在无 氧环境中能否利用碳源将细菌分为非发酵菌 (O/F阴性)和发酵菌（O/F阳性） 氧化酶试验： 肠杆菌的氧化酶（-），非发酵 菌多数氧化酶（+），但嗜麦芽窄食单胞菌和 不动杆菌的氧化酶（-）， 弧菌科氧化酶（+）
链球菌鉴定途径
β溶血
杆菌肽 S
A群链球菌
CAMP +
B群链球菌
胆汁七 叶苷 +
D群链球菌
6.5%NaCl -+
非肠球菌 肠球菌
链球菌鉴定途径
γ溶血
胆汁七 叶苷 + -D群链球菌 草绿色链球菌 6.5%NaCl +
肠球菌 非肠球菌
真菌的鉴定途径
沙包氏培养基选择性培养 科玛嘉念珠菌显色培养基 革兰氏染色：阳性、椭圆形、有芽孢状的 较大菌体 通过血清芽管形成试验鉴定出白念珠菌 CSF标本通过墨汁染色可以初步判断为新 型隐球菌
采集标本后立即送检！
标本接收原则
严格实行核对制度 ：包括姓名、性别、年
龄、门诊号/住院号、病床号、标本类型、容 器、标识、检验目的等。
所有拒收或退回标本均应在登记本上登 记，登记内容包括：病人姓名、病区、床号
送检医师、送检项目、拒收 ( 退回 ) 原因、拒收 时间、经手人等
痰标本涂片染色低倍镜下分类
无 菌 部 位 标 本
革兰阴性菌
葡萄球菌
2018/7/26
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痰培养真菌、链球菌菌落形态
细菌的初步分类
细菌的分离与纯化：自血平板挑出待检菌株
的单菌落进行初步的鉴定。如果混有杂菌，应 该重新转种分纯。
染色与镜检： 首先通过革兰氏染色确定基本
的分类：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-杆 菌（4）G+杆菌。此外，如果镜下发现革兰氏 染色阳性、椭圆形、有芽孢状的较大菌体，可 能是真菌。
抗酸染色注意事项
为防止交叉感染，标本先高压灭菌后再 涂片染色 染色充分 脱色时间宁长勿短 在涂抹痰标本时严禁对载玻片进行加热
临床标本培养基选择
血： 血培养瓶 中断尿：血平板、mac平板 脑脊液：血培养瓶、血平板、巧克力平 板 穿刺液：血培养瓶、血平板、巧克力平 板、mac平板 胆汁：血平板、巧克力平板、mac平板 大便:.麦康凯、SS、血平板
抗酸染色步骤
1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片 干燥 固定
抗酸染色步骤
2、染色包括初染、脱色、复染三步。
初染 脱色 复染
冲洗
石炭酸复红维持 3-5’
冲洗
美蓝复染1 ’
3%盐酸酒精30 ’’ ~1’
冲洗
干燥
油镜观察
抗酸染色结果
抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序，
偶呈分枝状生长。
背景及非抗酸性细菌呈兰色。
奈瑟氏菌属有11个种，临床就淋病奈 菌和脑膜炎奈瑟菌 最为重要
奈瑟氏菌属鉴定流程
菌落观察：灰色、湿润、透明或半透明、不溶血
涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状
氧化酶试验+ 触酶+ + 麦芽糖 脑膜炎奈瑟菌 -淋病奈瑟菌
莫拉菌属
莫拉菌有4个种，仅卡他莫 拉菌对人类有致病性
卡他莫拉菌鉴定
在血平板和巧克力平板上生长，mac上不 生长 血平板形成灰白色或红棕色、不溶血的 菌落，培养48小时，菌落表面干燥，接 种环可推移整个菌落且不粘环 革兰染色：G-双球菌，呈咖啡豆形 氧化酶和触酶都为阳性
接种工具
接种针和接种环 ：由三部分组成，即环 （针）、金属柄和绝缘 柄 接种针：用于穿刺接种细菌 接种环：用于固体、液体培养基的细菌 接种
器具：接种环（上）和接种针（下）
2—5cm 柄约22cm
5—8cm
金属柄约14.5cm
绝缘柄 约7.5cm
安装环(针)的螺口(约8mm)
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
--
--
--
+
+
需氧G+b的鉴定途径
根据抗酸染色（A）将其分为： A+：分枝杆菌、奴卡氏菌 A- ：李斯特菌属，芽胞杆菌属、棒状杆 菌属、乳酸杆菌属、 丹毒丝菌属等
需氧G+b的鉴定途径
属间鉴定，通过触酶和动力试验加以初步确定 触酶（+） + 动力 -
嗜血杆菌的鉴定途径
只能在营养条件高的巧克力平板上生长 ，菌落为中等大小、圆形、灰白色、透 明 革兰染色：G-小杆菌 卫星实验就可以帮助初步鉴定
百度文库
嗜血杆菌
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奈瑟氏菌属鉴定
在血平板和巧克力平板上生长，mac上不 生长 血平板形成灰色、湿润、透明或半透明 、不溶血的菌落 巧克力平板上形成圆形、灰蓝色的似露 滴状菌落 革兰染色： G-双球菌，呈肾形或咖啡豆 形，凹面相对 氧化酶和触酶都均为阳性
菌落的三个类型：
1.光滑型菌落（Smooth type Colony） ：又称S 型
2.粗糙型菌落（Rough type Colony）：又称R型
3.粘液型菌落（Mucoid type Colony）又称M型
S型菌落
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R型菌落
M型菌落
细菌在液体培养基中的生长现象
混浊 沉淀：多见于链状排列的细菌 菌膜：多见于厌氧菌
金黄色葡萄球菌
最重要的致病葡萄球菌 血平板上菌落有明显β溶血环，颜色呈金 黄色、灰白色或柠檬色 分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇 血浆凝固酶和DNA酶阳性
葡萄球菌
2018/7/26
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链球菌鉴定途径
链球菌属:触酶（-）、七叶苷（-）、 6.5%NaCl（-） 肠球菌：触酶（-）、七叶苷（+）、 6.5%NaCl（+）
卡他莫拉菌 鉴定流程
菌落观察：灰白色或红棕色、光滑 、不溶血、干燥 涂片染色：G-双球菌，呈肾形或咖啡豆状
氧化酶试验+ 触酶+ +
卡他莫拉菌
DNAM酶
-其他奈瑟氏菌
奈瑟氏菌属与相似菌鉴别的关键性试验
葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 硝酸盐还原 DNA酶
淋病奈瑟菌
脑膜炎奈瑟菌
+
+
-+
---
---
---
卡他莫拉菌
细菌在液体培养基中的生 长现象：
细菌在半固体培养基中的生长现象
有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向 外扩散生长，穿刺线边缘模糊。 无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线 边缘清晰。
细菌在半固体培养基中的生长现象
无动力 现象
有动力 现象
斜面接种法
接种斜面后菌落生长示意图（菌苔）
革兰染色
原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形
革兰染色步骤
涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片 干燥 固定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘 得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
革兰染色程序
初染 媒染 脱色 复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’ 1’
冲洗
碘液 1’
95%乙醇 30” 复红
滤纸干燥
油镜观察
革兰染色
细菌培养及鉴定
杭州余杭邦尔医院检验科 钟剑
标本采集原则
1.及时采集微生物标本作病原学检查 2.在抗菌药物使用前采集标本 3.采样时严格执行无菌操作
4.标本容器须无菌，但不得有消毒剂
5.采样后立即送检
6.送检标本应注明来源和检验目的
咳痰方法
病人先漱口，清洁口腔，去除表面的菌群
病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液
链球菌鉴定途径
根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然 后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判 断鉴定途径
链球菌鉴定途径
根据G染色和触酶结果确定为链球菌，然 后再根据细菌的溶血情况和菌落特点判 断鉴定途径
链球菌鉴定途径
α溶血
Optochin R S
+ 胆汁七 叶苷 -D群链球菌
肺炎链 球菌
草绿色链球菌
G-杆菌的鉴定途径
G染色 G-b
O/F试验和氧化酶（ox)试验
OF（-） ox（+） OF（+） ox（-） OF（+） ox（+）
非发酵型细菌
肠杆菌科
弧菌科
血清学试验
肠道致病菌生化特征符合的前提下必须 有血清学的试验作最后确认：
1.志贺氏菌多价和单价凝集血清
2.沙门氏菌多价和单价凝集血清
无痰可用3％～5％NaCl 5ml雾吸约5min导痰 以清晨第二口痰为佳 标本采集后放置时间不超过2小时
清洁中段尿液
尽量取早晨第一次尿液 嘱患者留取标本的前一天晚上少饮水 女性病人 收集标本前用肥皂水冲洗外阴，再以灭菌清水 冲洗尿道口 排出几毫升后，不停止尿流，采集中段尿 男性病人 翻转包皮，清洗尿道口 排出几毫升后，不停止尿流,采集中段尿
细菌在固体培养基中的生长现象
菌落 ★定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形 成单一肉眼可见的细菌集团。 ★菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透 明度、湿润度、黏度、溶血性 ★菌落类型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型 （ M） 菌苔：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物 。
菌落
菌落与菌苔
甲 菌
＋ ＋ 紫色（ G ） 紫色（ G ）
初染
媒染
脱色
革兰氏染色步骤示意图 乙醇 稀释复红 结晶紫 碘液
乙 菌 红色（G-）
复染
革兰染色步骤示意图
【结果】
细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
阳性菌——紫色（G+b 阴性菌——红色（G-b)
G+ 球菌
G-杆菌
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清
4. 耶尔森氏菌凝集血清
G+球菌的鉴定途径
1.首先根据菌落特点和革兰氏染色判断是 否为G+球菌。 2.根据触酶结果判断为葡萄球菌（微球菌 属）or链球菌（肠球菌） 3.葡萄球菌属：触酶（+）链球菌属及肠 球菌：触酶（-）
G+球菌的鉴定途径
葡萄球菌属：触酶（+）、氧化酶（-）、 O-F试验：发酵型 微球菌属：触酶（+）、氧化酶（+）、 O-F试验：氧化型
临床标本培养基选择
生殖道标本根据临床医生所写的检验项 目接种相应的平板及操作：
淋球菌培养接种淋球菌平板;念珠菌培养接 种沙保罗培养基；支原体培养则按《支原体培 养的操作规程》操作；作普通培养则接种血平 板和巧克力平板
观察细菌在平板上的生长现象
血平板：大小、形状、边缘、颜色、表 面、透明度、湿润度、黏度、溶血性 mac平板：大小、形状、颜色、透明度、 湿润度、黏度 巧克力平板：大小、形状、颜色、透明 度、湿润度、黏度