实验一 海泥中放线菌的分离与纯化

实验一海泥中放线菌的分离与纯化

实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。

2掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

3 掌握划线纯化放线菌的方法。

实验材料：

药品：酵母粉、葡糖糖、麦芽浸出粉、可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂等。

其他：高压蒸汽灭菌锅、电子天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、线绳、无菌培养皿、酒精棉球、镊子，等。

实验原理：

放线菌是重要的抗生素产生菌，海泥中含有大量的放线菌，由于海泥中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究海泥中的放线菌，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得放线菌菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释涂布法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基。海泥采用分散和差速离心法处理可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，几次纯化后可得到纯菌株。

实验步骤：

一、合成培养基的制备

（作为分离培养基，每组选一种）

1.高氏一号琼脂培养基

可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂18g，人工海水1000ml，pH7.2～7.4。100ug/ml的重铬酸钾

2. 2216E培养基

蛋白胨5g，酵母粉1g,磷酸高铁0.1g,琼脂18g，人工海水1L，自然PH

3. 无机盐琼脂培养基

淀粉20g，磷酸氢二钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，硝酸钾1g，七水硫酸亚铁0.01g，琼脂18g, 人工海水加到1L，自然PH

4.M4培养基

天门冬素0.1g，蛋白胨2g，K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.001g，琼脂18g, 人工海水加到1L，自然PH 5.M1培养基

淀粉10g，酵母粉4g，蛋白胨2g，琼脂18g，人工海水1L,自然PH

6.YEME培养基

酵母粉4g，麦芽浸出粉10g，葡糖糖4g，琼脂18g，人工海水1L,自然PH

7.改良Emerson培养基

葡萄糖1g,酵母粉1g，蛋白胨4g，氯化钠2.5g，琼脂18g，人工海水1L,自然PH

8.ISP2培养基

葡糖糖4g，酵母粉4g，麦芽浸出粉10g，碳酸钙2g，琼脂18g，人工海水1L，自然PH。

9. 改良脯氨酸培养基

脯氨酸5g，琼脂18g，人工海水加到1L，自然PH。

二、土壤中放线菌的分离与纯化

（1）待测样液的制备

分散和差速离心法：称取1 g土样，加人10mL胆酸钠(0.1 %/，w/v)，加入10颗左右玻璃珠，震荡30min，500g离心1min。将上层土壤悬液转移至另一干净管A内，下层土壤沉淀加人10Lm

冷的0.05mol/L Tris缓冲液(PH 7.4)，震荡30min，500g离心1min，将上层土壤悬液合并人管A内，得到第1步土壤处理液。

下层土壤沉淀加人10mL胆酸钠(0.1 %/，w/v)，低功率超声波水浴温和处理1min再加入10mL 胆酸钠(0.1 % w/v)，震荡30min。500g离心1min。将上层土壤悬液转移至管B内；加人10Lm冷的0.05mol/L Tris缓冲液(PH 7.4)，震荡30min，500g离心1min，将上层土壤悬液合并至管B内，到第2步土壤处理液。将剩余小颗粒沉淀重新悬浮在10mL蒸馏水中，震荡30min，得到第3步土壤处理液。

将3部分土壤处理液均于5000g离心20min，去上清，沉淀物分别重新悬于10ml的生理盐水，做10-1、10-2、10-3系列稀释，10-2、10-3稀释度取100ul进行平板涂布。

（2）涂布平板法分离土壤中放线菌

取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-2、10-3）、班别、姓名、操作日期等。每个稀释度做1个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的培养基20~25ml左右，待冷凝成平板。

用枪头从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-3）的平板上，再依次将10-2的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。

（3）培养

接种完毕，将平皿倒置放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌菌落。

（4）放线菌的纯化

涂布的平板长出放线菌菌落后，观察是否为放线菌（放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明具有泥腥味、而且有褶皱），初步判定为放线菌后，配制ISP2纯化培养基（葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽浸粉10g，碳酸钙2g,琼脂18-20g，人工海水1000ml）进行划线纯化。可采用以下两种划线的方法。

培养参照（3）。培养大概1周后，再次进行划线纯化。

三、实验报告

1.描述你所培养的放线菌的菌落形态特征。

3.如何区分放线菌和真菌、细菌？