高效油脂降解菌的筛选与鉴定
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３ ℃，５ ／ ｉ ， 养 ７ 。 ０ １０ ｒ ｎ 培 ａ ｒ ２ ｈ
富 集 培 养 基 ： 母 膏 ５ ｇ 蛋 白 胨 １ ／ 葡 酵 ／ Ｌ， ０ｇ Ｌ，
萄糖 ２ ／，菜籽油 ５ ｇＪＴ ｅｎ ８ ／ ，Ｈ值 ０ｇ ， ｌ ／ ，ｗ ｅ ０ ６ ｇ ｐ ｉ Ｌ
自然 ； 驯化 培养 基 ： ２ Ｏ ． ｇＬ Ｋ Ｐ ４１ ／ ， ＫＨＰ ４１ ／ ， Ｈ Ｏ ． ｇ ０ ０ Ｌ
Ｎａ Ｏ４ １ ／ ， Ｃ ． ／ Ｍｇ Ｏ４７ ０ ０５ ｇＬ， ＨＰ ． ｇＬ Ｎａ ］０５ ｇ ０ Ｌ， Ｓ ・Ｈ２ ． ／
１５ 驯 化培 养 。 ５ ｍ ．． ３ 取 Ｌ富集后 的菌 液 ， 接种 于含 ２ Ｌ驯化 培 养基 （ 菜 籽油 ５ ／）的 ２ ０ ｍ ５ｍ 含 ． ｇＬ ０ ５ Ｌ 三角 烧瓶 中 ， 于 ３ Ｉ，５ ／ｉ 置 ５ｃ １０ｒ ｎ的恒温 摇床 上培 二 ａ ｒ 养。 ３ｄ为 １ 周期 ， 周期 结束 后将 菌液 移 至含油 个 每 量为 １． ｇＬ的驯化 培养 基上 培养 。为 了抑制 细菌 ００ ／ 生长 ， 培养 基 中加 入 ８ ／ ０ ＵｍＬ的青霉 素 。
２期
罗跃 中等
高效 油 脂 降 解 菌 的 筛选 与 鉴 定
１ ３
１ 材料 与方 法
１１ 菌种 样 品 ．
１５ 方 法 －
１５１ 样 品预处 理 。取 １ ０ ｍ ．． ０ Ｌ无 菌水加 入 ２ ０ ｍ ０ Ｌ
菌 种 采 自学 院餐 厅 下 水 道 口及 洗 碗 下 水 处 污 水 及 污 泥 ； 天 桥 油 脂 加 工 厂 旁 边 污 泥 、 天 桥 屠 湘 湘 宰 场下水 沟 污水 及 泥 。
ｍＬ ５ ＋ ％石 炭 酸水 溶 液 ９ Ｌ ， ０ ｍ ） 吕氏美 兰染 液 （ 兰 美
小 。选取透明圈直径与菌落直径 比较大的菌落接种 斜面 保藏 。
１ ． 菌株 蛋 白酶 活法 复筛 。将 初筛 的菌 株接 种到 ．５ ５ 种 子 液 培养 基 中 ， 斜 面培 养 基上 的菌 种 接种 到 新 取 鲜 液体 种 子培 养基 中 ， 培养 １ ２ ｈ活化 菌种 。用灭 菌 的 １ ０ｍＬ移 液 管移 取 液体 种 子 ，接入 含 有 ２ ０ｍＬ ０ 上 述复筛 发酵 培养基 的 ３０ｍＬ三角瓶 中， ３ ℃， ０ 于 ０ １０ ｒ ｉ ５ ／ ｎ的恒 温 摇床 上 培 养 ３ 。然 后 采用 离 心 ａ ｒ ６ｈ 机 ３０ ０ｒ ｉ 心分 离 １ ｉ， 释适 当倍 数 ， ０ ／ ｎቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ａ ｒ ０ ｒｎ 稀 ａ 测 定 上 清 液脂 肪 酶 活性 。对 每个 菌株 平 行 测 定 ３次 ， 筛 选 出产脂 肪 酶活性 最 高 的菌株 。
配方参照《 微生物学实验教程（ ２ ）和《 第 版 》 常见细
菌 系统 鉴 定 手册 》 。该 研 究 中培养 基 除 特别 注 明 ］
外 均 采用 １ １℃蒸 汽灭 菌 ３ ｉ。 ２ ０ ｒ ｎ ａ
１ ． 试 剂 ３
酶 活测 定 用 溶 液 和试 剂 ：％聚 乙烯 醇 ，Ｈ ４８ ２ ｐ ． Ｋ ２Ｏ一 ａ Ｐ 冲 溶 液 ，．０ ０ ｍ ｌ ａ Ｈ ＨＰ ４Ｎ ２ Ｏ 缓 Ｈ ０１０ Ｏ ｏ Ｌ Ｎ Ｏ ／ 标 准 溶液 ， 榄 油 ，５ 橄 ９ ％乙醇 ，Ｏ ｇ １ ／ Ｌ酚酞 指示 剂 等 。 细 菌 鉴 定 用 试 剂 ： 兰 氏染 剂 （ 凯 生 化 试 剂 革 环 公司） ，石 炭 酸 复 红 液 （ 性 复 红 酒 精 饱 和 液 ｌ 碱 ０
吐温 一 ０平板 ，５ ℃培养 ４ ８ ３ ８～７ ，观察 透 明圈大 ２ｈ
白胨 ５ｇ ，葡萄糖 １ ／， ２Ｐ ４１ ／ ，Ｈ值 ／ Ｌ ． ｇ ， Ｈ Ｏ ． ｇ ｐ ０ ＴＫ ０ Ｌ 自然 ； 液体 发 酵 培 养 基 ｆ ）将 ２ 瓶 ： ５ ｇ菜 籽 饼 粉 末 装
入锥 形 瓶 加 蒸馏 水 至 ２０ ｍＬ ０ ；细 菌 鉴 定 用培 养 基
（ ） ｈｄ ｍｎ １Ｒ ｏａ ｉｅＢ筛 选法 ：取 １ｍＬ驯化 的菌 液 ， 入 ９ｍ 加 Ｌ无 菌水 ， 制成 起始 菌 液 ， 后 按 １之 然 ０、 ｌ １４ １ 、Ｏ ０ 、０ 、０ １ 浓 度 稀 释 ，各 取 Ｏ１ｍ ． Ｌ涂 布 在 Ｒ ｏａ ｉ 选择ｌ平板上 （Ｏｃ ｈｄ ｍｎ Ｂ ｅ 生 ６ 时加入过滤除菌的 Ｃ Ｒ ｏａ ｎ ）３ Ｃ ｈ ｄｍｉｅＢ ，５ｃ培养 ４ ～ ２ｈ然后在 ３０ｎｎ ８ ７ ， ５ ｉ紫 外光下观察 ， 依据平板上形成的荧光 圈大小进行筛选 。 （） ２ 吐温 一 ０ 选 法 ： ｌｍＬ驯化 的菌 液 ， 人 ８筛 取 加 ９ｍＬ无 菌水 ， 制成起 始 菌 液 ， 匀 后取 ０１ｍ 混 ． Ｌ涂 布
１２ 培 养基 ．
锥形 瓶 ， 入玻 璃珠 和采 集 的样 品 ， 置在 调速 多用 加 放 振荡 器 （Ｉ４ 振荡 １ｈ打碎 菌胶 团 ， Ｉ ） － Ｙ ， 释放游 离菌 。 １５２ 富集培 养 。 ５ ｍ ．． 取 Ｌ震 荡 后 的菌悬 液样 品 ， 接 种 于含 ３ Ｌ富集 培 养 基 的 ２ ０ｍＬ三 角烧 瓶 中。 ５ｍ ５
１５４ 平 板初 筛 。 ．．
ｐ Ｈ值 自然 ； 平板筛选培养基 ： 白胨 ５ｇ ， 蛋 ／ 酵母膏 Ｌ ５ｇ ， ／ 葡萄糖 １ ／， ２Ｐ ４１ ， 籽 油 ３ ， Ｌ ． ｇ ＫＨ Ｏ ． ０ Ｌ ０ 菜
琼 脂 １ ／，．％过 滤 灭 菌 的 Ｒ ｏａ ｉｅＢ溶 液 ； ５ ｇＬ ０２ ｈｄｍｎ 平 板划 线 培 养 基 与斜 面保 藏 培 养 基 ： 母 膏 ５ ｇＬ 酵 ／， 蛋 白胨 ５ Ｌ 葡萄 糖 １ ／， ２ Ｏ ． ｇ 琼 脂 ， ． ｇ ＫＨＰ ４１ ／ ０ Ｌ ０ Ｌ， ｌ ／ ｐ 自然 ； ５ｇ Ｈ Ｌ， 液体 种 子培 养 基 ： 酵母 膏 ５ ｇＬ 蛋 ／，
富 集 培 养 基 ： 母 膏 ５ ｇ 蛋 白 胨 １ ／ 葡 酵 ／ Ｌ， ０ｇ Ｌ，
萄糖 ２ ／，菜籽油 ５ ｇＪＴ ｅｎ ８ ／ ，Ｈ值 ０ｇ ， ｌ ／ ，ｗ ｅ ０ ６ ｇ ｐ ｉ Ｌ
自然 ； 驯化 培养 基 ： ２ Ｏ ． ｇＬ Ｋ Ｐ ４１ ／ ， ＫＨＰ ４１ ／ ， Ｈ Ｏ ． ｇ ０ ０ Ｌ
Ｎａ Ｏ４ １ ／ ， Ｃ ． ／ Ｍｇ Ｏ４７ ０ ０５ ｇＬ， ＨＰ ． ｇＬ Ｎａ ］０５ ｇ ０ Ｌ， Ｓ ・Ｈ２ ． ／
１５ 驯 化培 养 。 ５ ｍ ．． ３ 取 Ｌ富集后 的菌 液 ， 接种 于含 ２ Ｌ驯化 培 养基 （ 菜 籽油 ５ ／）的 ２ ０ ｍ ５ｍ 含 ． ｇＬ ０ ５ Ｌ 三角 烧瓶 中 ， 于 ３ Ｉ，５ ／ｉ 置 ５ｃ １０ｒ ｎ的恒温 摇床 上培 二 ａ ｒ 养。 ３ｄ为 １ 周期 ， 周期 结束 后将 菌液 移 至含油 个 每 量为 １． ｇＬ的驯化 培养 基上 培养 。为 了抑制 细菌 ００ ／ 生长 ， 培养 基 中加 入 ８ ／ ０ ＵｍＬ的青霉 素 。
２期
罗跃 中等
高效 油 脂 降 解 菌 的 筛选 与 鉴 定
１ ３
１ 材料 与方 法
１１ 菌种 样 品 ．
１５ 方 法 －
１５１ 样 品预处 理 。取 １ ０ ｍ ．． ０ Ｌ无 菌水加 入 ２ ０ ｍ ０ Ｌ
菌 种 采 自学 院餐 厅 下 水 道 口及 洗 碗 下 水 处 污 水 及 污 泥 ； 天 桥 油 脂 加 工 厂 旁 边 污 泥 、 天 桥 屠 湘 湘 宰 场下水 沟 污水 及 泥 。
ｍＬ ５ ＋ ％石 炭 酸水 溶 液 ９ Ｌ ， ０ ｍ ） 吕氏美 兰染 液 （ 兰 美
小 。选取透明圈直径与菌落直径 比较大的菌落接种 斜面 保藏 。
１ ． 菌株 蛋 白酶 活法 复筛 。将 初筛 的菌 株接 种到 ．５ ５ 种 子 液 培养 基 中 ， 斜 面培 养 基上 的菌 种 接种 到 新 取 鲜 液体 种 子培 养基 中 ， 培养 １ ２ ｈ活化 菌种 。用灭 菌 的 １ ０ｍＬ移 液 管移 取 液体 种 子 ，接入 含 有 ２ ０ｍＬ ０ 上 述复筛 发酵 培养基 的 ３０ｍＬ三角瓶 中， ３ ℃， ０ 于 ０ １０ ｒ ｉ ５ ／ ｎ的恒 温 摇床 上 培 养 ３ 。然 后 采用 离 心 ａ ｒ ６ｈ 机 ３０ ０ｒ ｉ 心分 离 １ ｉ， 释适 当倍 数 ， ０ ／ ｎቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ａ ｒ ０ ｒｎ 稀 ａ 测 定 上 清 液脂 肪 酶 活性 。对 每个 菌株 平 行 测 定 ３次 ， 筛 选 出产脂 肪 酶活性 最 高 的菌株 。
配方参照《 微生物学实验教程（ ２ ）和《 第 版 》 常见细
菌 系统 鉴 定 手册 》 。该 研 究 中培养 基 除 特别 注 明 ］
外 均 采用 １ １℃蒸 汽灭 菌 ３ ｉ。 ２ ０ ｒ ｎ ａ
１ ． 试 剂 ３
酶 活测 定 用 溶 液 和试 剂 ：％聚 乙烯 醇 ，Ｈ ４８ ２ ｐ ． Ｋ ２Ｏ一 ａ Ｐ 冲 溶 液 ，．０ ０ ｍ ｌ ａ Ｈ ＨＰ ４Ｎ ２ Ｏ 缓 Ｈ ０１０ Ｏ ｏ Ｌ Ｎ Ｏ ／ 标 准 溶液 ， 榄 油 ，５ 橄 ９ ％乙醇 ，Ｏ ｇ １ ／ Ｌ酚酞 指示 剂 等 。 细 菌 鉴 定 用 试 剂 ： 兰 氏染 剂 （ 凯 生 化 试 剂 革 环 公司） ，石 炭 酸 复 红 液 （ 性 复 红 酒 精 饱 和 液 ｌ 碱 ０
吐温 一 ０平板 ，５ ℃培养 ４ ８ ３ ８～７ ，观察 透 明圈大 ２ｈ
白胨 ５ｇ ，葡萄糖 １ ／， ２Ｐ ４１ ／ ，Ｈ值 ／ Ｌ ． ｇ ， Ｈ Ｏ ． ｇ ｐ ０ ＴＫ ０ Ｌ 自然 ； 液体 发 酵 培 养 基 ｆ ）将 ２ 瓶 ： ５ ｇ菜 籽 饼 粉 末 装
入锥 形 瓶 加 蒸馏 水 至 ２０ ｍＬ ０ ；细 菌 鉴 定 用培 养 基
（ ） ｈｄ ｍｎ １Ｒ ｏａ ｉｅＢ筛 选法 ：取 １ｍＬ驯化 的菌 液 ， 入 ９ｍ 加 Ｌ无 菌水 ， 制成 起始 菌 液 ， 后 按 １之 然 ０、 ｌ １４ １ 、Ｏ ０ 、０ 、０ １ 浓 度 稀 释 ，各 取 Ｏ１ｍ ． Ｌ涂 布 在 Ｒ ｏａ ｉ 选择ｌ平板上 （Ｏｃ ｈｄ ｍｎ Ｂ ｅ 生 ６ 时加入过滤除菌的 Ｃ Ｒ ｏａ ｎ ）３ Ｃ ｈ ｄｍｉｅＢ ，５ｃ培养 ４ ～ ２ｈ然后在 ３０ｎｎ ８ ７ ， ５ ｉ紫 外光下观察 ， 依据平板上形成的荧光 圈大小进行筛选 。 （） ２ 吐温 一 ０ 选 法 ： ｌｍＬ驯化 的菌 液 ， 人 ８筛 取 加 ９ｍＬ无 菌水 ， 制成起 始 菌 液 ， 匀 后取 ０１ｍ 混 ． Ｌ涂 布
１２ 培 养基 ．
锥形 瓶 ， 入玻 璃珠 和采 集 的样 品 ， 置在 调速 多用 加 放 振荡 器 （Ｉ４ 振荡 １ｈ打碎 菌胶 团 ， Ｉ ） － Ｙ ， 释放游 离菌 。 １５２ 富集培 养 。 ５ ｍ ．． 取 Ｌ震 荡 后 的菌悬 液样 品 ， 接 种 于含 ３ Ｌ富集 培 养 基 的 ２ ０ｍＬ三 角烧 瓶 中。 ５ｍ ５
１５４ 平 板初 筛 。 ．．
ｐ Ｈ值 自然 ； 平板筛选培养基 ： 白胨 ５ｇ ， 蛋 ／ 酵母膏 Ｌ ５ｇ ， ／ 葡萄糖 １ ／， ２Ｐ ４１ ， 籽 油 ３ ， Ｌ ． ｇ ＫＨ Ｏ ． ０ Ｌ ０ 菜
琼 脂 １ ／，．％过 滤 灭 菌 的 Ｒ ｏａ ｉｅＢ溶 液 ； ５ ｇＬ ０２ ｈｄｍｎ 平 板划 线 培 养 基 与斜 面保 藏 培 养 基 ： 母 膏 ５ ｇＬ 酵 ／， 蛋 白胨 ５ Ｌ 葡萄 糖 １ ／， ２ Ｏ ． ｇ 琼 脂 ， ． ｇ ＫＨＰ ４１ ／ ０ Ｌ ０ Ｌ， ｌ ／ ｐ 自然 ； ５ｇ Ｈ Ｌ， 液体 种 子培 养 基 ： 酵母 膏 ５ ｇＬ 蛋 ／，