BLOTHP幽门螺杆菌抗体分型

HP检测方法的比较
方法 组织学法 细菌培养 尿素酶法
PCR UBT
金标法 ELISA WBT
取材方式 胃镜 胃镜 胃镜 胃镜 吹气
取血 取血 取血
所需时间 数小时
数天 数分钟 数小时 数小时
数分钟 数小时 数小时
辅助设备 病理检查设备 Hp培养设备
不需要 PCR检测设备 质谱仪或放射性物
质检测仪 不需要 酶标仪 不需要
2005年诺贝尔医学奖
2005年10月3日，瑞典卡罗林斯卡 医学院宣布，把2005年诺贝尔生 理学或医学奖授予澳大利亚科学 家Barry J. Marshall和J. Robin Warren，以表彰他们发现了导致 胃炎和胃溃疡的细菌-幽门螺杆菌。 诺贝尔奖委员会在授奖词中说， 由于Barry J. Marshall和J. Robin Warren的发现，使得原本慢性的、 经常无药可救的胃溃疡变成了只 需抗生素和一些其他药物短期就
获奖证书
免疫印迹法背景介绍
免疫印迹技术：它与内切酶的发现和PCR基因扩增技术一起，在上世纪做 为分子生物学领域三大发现之一。给人类生物工程带来了革命性进展。
基本原理：将提取的蛋白混合物先进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白 质按照分子量大小不同分离然后再转印至印迹膜，显色后按照显色带位置 不同判断分子量多少和所含蛋白质数量，称为Southern blot。
幽门螺杆菌根治适应证： 消化性溃疡 胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤 慢性胃炎伴胃粘膜萎缩、糜烂 慢性胃炎伴消化不良症状 ……… 个人要求治疗
亚洲HP的流行病学
中国的HP流行病学
华北地区---------46.84%
58.27%--------华西地区
华东地区--------59.36% 华中地区-------------66.26% 华南地区----------50.08%
其制造主要有三个工序： 将蛋白质经凝胶电泳按分子量大小不同依次分离； 将分离的组分转印到印迹膜上； 对转印到印迹膜的蛋白成分进行免疫学检测。
免疫印迹检测原理
本产品是将CagA、VacA的菌体抗原利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 将蛋白按分子量大小不同依次分开，再转印至印迹膜上。
采用酶联免疫反应技术，如果被检者血清有相应抗体则在抗 原的相应位置出现显色区带，根据条带显色位置判断被检血清中 各种HP抗体。
幽门螺杆菌及其分型的临床意义
幽门螺杆菌（H.pylori ）
• 1982年澳大利亚学者Marshall和Warren从 胃黏膜中分离出Hp
– 常见于人的胃窦和幽门部位 – 可通过一端多条鞭毛移动 – 是一种革兰氏阴性螺旋菌 – 分泌高活性的尿素酶和过氧化氢酶 – VacA、CagA导致宿主的炎症反应
能否分型 否 否 否 否 否
否 否 能
小结
✓HP和消化道疾病密切相关，检测很重要 ✓中国健康人群HP感染率59%，检测量很大 ✓目前主流的呼气试验和血清抗体检测，没有检测毒性
幽门螺杆菌的致病机制
HP基因多态性是造成HP感染后不同临床结局主要的原因， 现 在 认 为 与 空 泡 毒 素 A （ VacA ） 基 因 和 细 胞 毒 相 关 基 因 （CagA）及其基因表达的蛋白质与致病有关。
尿素酶（Urease ）：幽门螺杆菌能够在胃里 生存只要依靠尿素酶。尿素酶可以分解产生 的氨，使细胞能量代谢发生障碍，并出现病 理性改变。
HP分型的定义
Ⅰ型：产细胞毒素HP菌株，其检出率约占总HP感染的50％～ 60％。这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害， 引起溃疡和诱发癌变。
Ⅱ型：不产生细胞毒素的HP，即：Cag A(-)和Vac A(-)，这 一类HP菌株毒性较小，感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而 无临床症状。
Maastricht1-1995年观点
强烈地建议治疗
消化道溃疡疾病 消化道出血性溃疡 低级别胃粘膜相关淋巴瘤 有严重反常的胃炎 胃癌切除术之后早期
亚太地区共识-1997年观点
推荐指征:
消化道溃疡疾病 溃疡出血或穿孔 伴有溃疡和消化不良病史,NSAID 治疗 早期胃癌切除术 低级别胃粘膜相关淋巴瘤 胃癌家族史 消化不良（检测到Hp ）
由抗体出现的种类不同推断HP类型，再根据显色带的强弱、 消长可观察治疗效果，预测溃疡有无复发的可能性。
反应过程
实验材料
✓ 蒸馏水 ✓ 1000ul可调加样枪一支
10ul加样枪一支 吸嘴 ✓ 500ml带盖瓶 ✓ 摇床一台
操作步骤
1. 在量杯中将浓缩洗涤液用蒸馏水按 1：10 的比例稀释成洗涤应用液。 2. 每槽加入洗涤液1ml， 再加待测血清或全血10ul， 放在摇床上摇动30分钟。 3. 取出反应槽，弃去槽中液体，并在平铺的纸巾上将其倒置经磕以拍干剩余液体，
VacA和CagA蛋白是HP毒素的主要标志。部分革兰阴性 和阳性致病菌的染色体上毒力因子基因的特殊区域称为“致 病岛”。CagA致病岛是HP的主要毒力因子。CagA基因序列 的拓展研究发现，CagA是Cag致病岛中基因之一，CagE是诱 导胃上皮细胞产生白介素8（IL）的主要基因，IL 是诱发胃 黏膜炎症的主要细胞因子。
内科学(p.380)
幽门螺杆菌作为慢性浅表性胃炎最主要病因的确 立基于如下证据： 1，绝大多数慢性活动性胃炎患者胃粘膜中可检出 幽门螺杆菌； 2，幽门螺杆菌在胃内的分布与胃内炎症分布一致； 3，根除幽门螺杆菌可使胃粘膜炎症消退； 4，从志愿者和动物模型中可复制幽门螺杆菌感染 引起的慢性胃炎。
…………….幽门螺杆菌通过上述产氨作用、分泌 空泡毒素A（VacA)等物质而引起细胞损害；其细 胞毒素相关基因（CagA)蛋白能引起强烈的炎症反 应；其菌体胞壁还可作为抗原诱导免疫反应。这 些因素的长期存在导致胃粘膜的慢性炎症。
Marshall和Warren
1979年根据活组织切片检查结果， Warren发现50%左右的病人的胃 腔下半部分附生着许多微小的、 弯曲状的细菌。Warren的发现引 来了同行的质疑，但也引起了 Marshall的极大兴趣，他们决定 联合对取自100个病人的活组织 切片进行研究。 经过反复试验，Marshall成功地 培育出一种当时尚不为人知晓的 细菌——后来被命名为幽门螺杆 菌。基于试验结果，Marshall和 Warren认为，幽门螺杆菌是导致 胃炎、十二指肠溃疡或胃溃疡的 关键因素。发现这种细菌，使胃 炎、十二指肠溃疡或胃溃疡的诊 断治疗变得及其简单。
HP毒力因子
空泡毒素（Vac A）：是 HP 分泌的一种蛋 白毒素 ，可引起作用的靶细胞发生空泡化 、 细胞凋亡、 细胞骨架重排、甚至细胞死亡 等形态学改变，是HP重要的毒力因子。
细胞毒素(CagA)：虽不直接介导毒素活性， 但与空泡毒素（Vac A）的表达密切相关， 常与空泡毒素（Vac A）同时存在，故将其 命名为HP细胞毒素相关蛋白简称CagA。 CagA可能与 Vac A的转录、折叠运转及功能 有关，CagA可导致宿主出现严重的炎症反应。
HP分型的临床意义
HP分型能为临床开展“选择性根治”提供了重要的实验诊断依据。 对于感染了HP的上消化道疾病患者，应引起临床医师的足够重视， 进行毒力分型检测，帮助制定根除 HP 、 胃镜及病理检查随访的诊疗 计划 ，利于胃癌的预防并合理节约医疗资源。 Ⅰ型：产细胞毒素HP菌株，其检出率约占总HP感染的50％～60％。 这类菌株感染能使胃上皮细胞出现空泡、变形和损害，引起溃疡和诱发 癌变。 Ⅱ型：不产生细胞毒素的HP，即：Cag A(-)和Vac A(-)，这一类HP 菌株毒性较小，感染后一般仅引起慢性浅表性胃炎而无临床症状。 Ⅰ型的HP感染者中的胃癌和溃疡的患病率显著高于Ⅱ型HP的感染者， 说明Ⅰ型HP感染可能更易导致较为严重的上消化道疾患，如溃疡或癌肿。 因此，Ⅰ型HP感染患者有必要进行根除治疗
参考：张万岱，胡伏莲等. 中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查.，2006
HP检测的方法
侵入性方法（依赖胃镜活检）
快速尿素酶试验（RUT） 病理切片染色 细菌培养 基因检测（PCR等）
非侵入性方法（不依赖内径检查）
13C或14C尿素酶呼气试验（UBT） 粪便Hp抗原检测（HpSA) 血清和分泌物抗体检测 基因芯片，蛋白芯片检测等
Maastricht2-2000年观点
强烈建议治疗
DU/ GU( 活动的或不活动，包括PUD) 胃粘膜相关淋巴瘤 萎缩性胃炎 胃癌切除术后 GC 病人的直系亲属 病人的要求
Maastricht3-2005年观点ຫໍສະໝຸດ Baidu
对于检测准确性高的可 以确认Hp感染的血清学检测 方法，可以用于Hp现症感染 的检测
中国庐山共识-2007年观点
该项目研究人员采用Hp重组CagA建立了检测Hp的血清学方法,并研制出 可同时检测血清CagA 、VacA和尿素酶抗体的免疫印迹诊断试剂盒,可判 断Hp毒力。该技术可覆盖国内95%以上的临床检测需要和科研需求。 同时,研究人员根据Hp毒力进行选择性根治,将已有的Hp根治方案进行优 化,增强了治疗的针对性和有效性,节约了医疗资源。（中国医学论坛报）
每槽加入洗涤液1ml，摇动洗涤1分钟，弃去槽中液体，并在平铺的纸巾上将其倒 置经磕以拍干剩余液体，重复洗涤3次； 4. 每槽加入洗涤应用液500ul，再加酶联试剂10ul，放在摇床上摇动30分钟。 5. 同（ 3 ）洗涤3次。 6. 加显色剂 0.5ml，5分钟后观察结果。 7. 待质控带和阳性带显色清晰，弃去槽内液体，用流水（自来水或蒸馏水）冲洗后 取出印迹膜，等干后对比《标准带》判断结果。
李教授介绍,该项目针对Hp毒力因子众多、致病机制复杂、临床诊断有 待规范等问题,开展了大规模流行病学调查,筛选出Hp两个重要致病因 子——CagA 和VacA,同时证明了CagA是导致消化性溃疡发生的关键因 子,也是胃癌发生的重要危险因素。研究小组发现,Hp中国菌株的CagA 、 VacA和致病岛阳性率高、毒力强,阐明了Hp的“中国特色”。研究者还 提出Hp分类学说,认为Hp菌株分为有毒株(CagA 、VacA阳性)和无毒株 (CagA 、VacA阴性)。该学说得到学术界广泛认同,被SCI他引407次。
深圳市伯劳特公司
国内刚刚拿到、唯一有产品注册证的幽门螺杆菌分型检测试剂盒生产商
研发过程
2000年7月获得中检所新生物制品审评检验报告 2002年5月上海医疗器械质量监督检验中心的注册检验 2002年7月瑞金医院的临床试验报告 2002年7月长宁区中心医院的临床试验报告 2002年8月上海市药监局颁发医疗器械注册证 2003年12月国家药监局颁发医疗器械注册证 2005年6月和2007月7月北京医疗器械质量监督检验中心的注 册检验 2007年12月获得国家科技进步二等奖。 2010年1月完成上海长海医院、青海省人民医院和吉林大学 中日友谊医院临床试验。 2010年3月获得中国药品生物制品检定所 注册检验报告 2011年7月获得国家食品药品监督管理局 产品注册证
伟大的发现
1983年Marshall写论文投给某杂志， 但遭到编辑部的拒绝：“我们需要 56篇文章，而你是第67篇。
1984 年7 月，Marshall 决 定用自己 的胃做实验，他把60毫升的幽门螺 杆菌培养液喝了下去！14天后，马 歇尔出现了明显的恶心、呕吐症状， 10天后的胃镜检查发现他确实患了 胃炎。
HP分型的治疗建议
Ⅰ型感染
胃镜检查 无症状
不需治疗
需治疗 有症状
个人意愿
Ⅱ型感染
李兆申
上海政府网站截图
2007国家科技进步二等奖
上海长海医院消化内科李兆申教授等筛选出幽门螺杆菌(Hp)的重要致病 因子——细胞毒素相关抗原(CagA)和空泡变性细胞毒素(VacA)。研究者 还提出Hp毒力存在差异的新理论,并应用Hp重组CagA建立检测CagA的 血清学方法,研制相关的检测试剂盒。相关成果日前获得2007年度国家 科学技术进步二等奖。
可治愈的疾病。
幽门螺杆菌与消化道疾病
慢性胃炎
1 4
胃癌
消化性溃疡
2 3
MALT淋巴瘤
1994年世界卫生组织（WHO）把Hp归为一级致癌物
内窥镜诊断
传播途径
幽门螺杆菌能在人体内生长、繁殖，又能通过 粪便及唾液排出体外，人是幽门螺杆菌的传染源。
它通过口－口传播、粪一口传播、经内窥镜传 播或密切接触等方式进行传播。