实验八 重组子的筛选和鉴定
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基因工程实验
重组子的筛选和鉴定
主讲人：王兴平 E－mail：nwsuafwxp@163.com
主讲人：王兴平
E-mail: nwsuafwxp@163.com
基因工程实验
一、实验目的
熟悉α互补筛选的原理 掌握重组子筛选的方法 掌握重组子鉴定的方法
主讲人：王兴平
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基因工程实验
二、实验原理
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选 出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出 质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
主要是利用PCR原理或者α互补原理，进行重组子
的筛选。
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α 互 补 的 筛 选
主讲人：王兴平
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
1．重组子筛选（α互补）
给4l IPTG和40l X-gal充分混匀后用三角玻棒 均匀地涂布于含100g/mL Amp的LB选择性平板 上，然后涂布重组子菌液。 37度培养过夜。 将平皿放在4度冰箱内0.5h，待兰白斑现色明显。
基因工程实验
参考资料
主讲人：王兴平
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基因工程实验
思考题
1. PCR法筛选的优点和缺点是什么？ 2. 重组子筛选方案中哪个更可靠，为什么？ 3. 最终确认重组子的方法有哪些？
主讲人：王兴平
E-mail: nwsuafwxp@163.cБайду номын сангаасm
基因工程实验
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
6. 现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。 7. 分装200管（每管200 l），投入液氮快速冷冻后， -70℃保存。 8. 用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明 感受态细胞的效价高。
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
2．重组子鉴定：
测序
（1）挑取白斑阳性克隆菌液，扩大培养 （2）按照质粒抽提试剂盒说明书，提取质粒。 （3）质粒送公司测序列 （4）测序结果进行比对，序列一致者为阳性克隆。
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基因工程实验
三、实验器材、试剂
1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴
（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿
（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻 璃涂棒，恒温培养箱。 2.试剂：30%甘油、0.1M CaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、
白斑菌落即为阳性克隆的重组子。
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
2．重组子鉴定：
菌液PCR
（1）挑取白斑阳性克隆菌液，扩大培养。
（2）以菌液为模板，进行PCR反应。其PCR引物、反应体 系与反应条件与“目的基因分离”实验的条件相同。 （3）PCR产物进行电泳，有目的片段出现者为阳性克隆。
外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。
3. 分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转， 4℃离心5min。
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
4. 弃 上 清 ， 每 管 加 10mL 预 冷 至 0℃ 的 0.1M CaCl2 （液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每 管 再 补 10mL 0.1M CaCl2 至 40mL ， 冰 浴 30min ， 4000转，4℃离心5min。 5. 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2后， 重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得 感受态细胞。
X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平
板 。
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
1. 复苏Ecoli JM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃
培养9-10h。 2. 挑单菌落接种于300mL LB液体培养基（三角瓶）中， 37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中， 37℃振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫
重组子的筛选和鉴定
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一、实验目的
熟悉α互补筛选的原理 掌握重组子筛选的方法 掌握重组子鉴定的方法
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基因工程实验
二、实验原理
利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选 出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出 质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。
主要是利用PCR原理或者α互补原理，进行重组子
的筛选。
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α 互 补 的 筛 选
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
1．重组子筛选（α互补）
给4l IPTG和40l X-gal充分混匀后用三角玻棒 均匀地涂布于含100g/mL Amp的LB选择性平板 上，然后涂布重组子菌液。 37度培养过夜。 将平皿放在4度冰箱内0.5h，待兰白斑现色明显。
基因工程实验
参考资料
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基因工程实验
思考题
1. PCR法筛选的优点和缺点是什么？ 2. 重组子筛选方案中哪个更可靠，为什么？ 3. 最终确认重组子的方法有哪些？
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基因工程实验
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
6. 现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。 7. 分装200管（每管200 l），投入液氮快速冷冻后， -70℃保存。 8. 用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明 感受态细胞的效价高。
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
2．重组子鉴定：
测序
（1）挑取白斑阳性克隆菌液，扩大培养 （2）按照质粒抽提试剂盒说明书，提取质粒。 （3）质粒送公司测序列 （4）测序结果进行比对，序列一致者为阳性克隆。
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基因工程实验
三、实验器材、试剂
1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴
（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿
（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻 璃涂棒，恒温培养箱。 2.试剂：30%甘油、0.1M CaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、
白斑菌落即为阳性克隆的重组子。
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基因工程实验
五、重组子筛选与鉴定操作步骤
2．重组子鉴定：
菌液PCR
（1）挑取白斑阳性克隆菌液，扩大培养。
（2）以菌液为模板，进行PCR反应。其PCR引物、反应体 系与反应条件与“目的基因分离”实验的条件相同。 （3）PCR产物进行电泳，有目的片段出现者为阳性克隆。
外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。
3. 分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转， 4℃离心5min。
主讲人：王兴平
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
4. 弃 上 清 ， 每 管 加 10mL 预 冷 至 0℃ 的 0.1M CaCl2 （液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每 管 再 补 10mL 0.1M CaCl2 至 40mL ， 冰 浴 30min ， 4000转，4℃离心5min。 5. 弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1M CaCl2后， 重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得 感受态细胞。
X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平
板 。
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基因工程实验
四、感受态细胞的制备
1. 复苏Ecoli JM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃
培养9-10h。 2. 挑单菌落接种于300mL LB液体培养基（三角瓶）中， 37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中， 37℃振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫