硅胶柱层析

②湿法：把被分离的样品溶于少量色谱最初使用的洗脱剂中， 小心加在吸附剂上层，注意上样时，必须使柱内洗脱剂刚好 覆盖吸附剂平面，并保持吸附剂表面为一水平面，打开下口， 待溶液正好流至与吸附剂上表面一致时，加少量洗脱剂（少 量多次），淋洗柱壁，关闭柱下端活塞。
2.4洗脱
通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比 例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少 或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中 应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。
3、色谱柱的选择 柱子可以分为：减压柱，加压柱，常压柱。
①减压柱：减少硅胶的用量，但大量的空气通过硅胶会使 溶剂挥发以及有些比较易分解的东西可能得不到，且必须 同时使用水泵抽气（噪音大，时间长）
②加压柱：与常压柱类似，外加压力使淋洗剂走的快些 （压缩空气提供压力）在容易分解的样品的分离中用时压 力不可过大（溶剂走的太快就会减低分离效果）
硅胶一般选用200-300和300-400目 2.2 实验仪器准备
一支玻璃色谱柱,一个铁架台,烧杯,锥形瓶,径口直径较大的 玻璃漏斗,一支玻璃棒等。
2.3 装柱
2.3.1 吸附剂的加入
①干法：用带有砂芯板的色谱柱（或在普通色谱柱下端加少 许棉花或玻璃棉），打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓 加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致。
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4 溶剂的选择 （展开剂选择） 溶剂的选择是整个柱色谱分离操作中困难之处,也是实验成 功的关键之处.溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行 筛选.
一般的选择是：
极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统
极性较大的用甲醇：氯仿系统
极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统
拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
匀浆法
1、称量 200-300目硅胶，称30-70倍于上样量。干硅胶的视密度在 0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。
2.3.2加样 ①干法：当被分离物质难溶于最初使用洗脱剂时，可选用一种
对其溶解度大而且沸点低的溶剂，将样品溶于尽可能少的该 溶剂中，将溶液加入适量吸附剂中或将吸附剂加入溶液中， 拌匀，挥干溶剂，研磨使之成为松散均匀的粉末，轻轻撒在 色谱柱吸附剂上面，再撒一层保护用细砂或所用吸附剂。注 意干法装柱时，色谱柱的活塞应处于开启的状态。
2、搅成匀浆 加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱 剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗 脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆， 说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸 乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用 无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1% 的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
②湿法：将吸附剂加入合适量的色谱最初使用的洗脱剂，调 成糊状，打开带有砂芯板的色谱柱（或预先在下端加少许 棉花或玻璃棉的普通色谱柱）的下口，然后徐徐将制好的 糊浆灌入柱子。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气 泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上端有溶剂，切 勿流干。最后让吸附剂自然下沉，当洗脱剂刚好覆盖吸附 剂平面时，关紧下口活塞。
硅胶柱层析技术 王文哲
▪ 色谱法，又称层析法.是一种以分配平衡为 机理的分配方法.
▪ 色谱体系包含两个相,一个是固定相,一个是
流动相.当两相相对运动时反复多次利用混
合物中所含各组分分配平衡性质的差异,最 后达到彼此分离的目的
▪ 色谱法按固定相可分为
1. 柱色谱 2. 平板色谱 3. 棒色谱 实验室中最常用的是柱层析（常说的过柱子）和
薄层层析,以及它们之间的配合应用。 柱色谱固定相通常是硅胶、氧化铝、聚酰胺、活 性炭
1、吸附色谱的原理 一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作用 主要是物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面 与溶质分子之间的范德华力；化学作用主要是硅胶表面的 硅羟基与待分离物质之间的氢键作用。
2、操作 2.1 硅胶准备
2.5.2 正式检测
①点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样 （若冲洗溶液太稀,浓度太小,先浓缩）。点样斑点 的直径一般为3-5mm.
②展开:在普通的展开槽中进行,展开方式常选用上 行展开.
③展开剂:使用冲洗溶液.
④显色:一般常用物理检测法和化学检测法.物理检 测法中首先有紫外光法（常用两种波长254nm与 365nm）化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾.显 色剂有通用显色剂（最常见的是硫酸-乙醇，显色 时间颜色都可能不一样）和专用显色剂（对某个 或某一类化合物显色的试剂）
③常压柱：优点是分离效率比经典的化学分离方法高的多， 与其他色谱法相比，不需要昂贵的仪器设备，更换流动相 和吸附剂方便，消耗材料少，成本低，适合分离取样量从 克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学实验室中被 广泛应用。
压力能增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但 减低柱子塔板数。所以其他条件相同的时候常压柱效率最 高，但时间也最长。
2.6 合并 根据薄层检测的结果,将具有相同Rf值的部分合并,然后利 用旋转蒸发器对合并部分进行旋蒸,最后得到目标产物.
2.7色谱柱的洗涤 通常硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用,但使用后的色谱柱 中含有冲洗溶剂,所以较难倒出. 取出硅胶方法：1、将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发 完后,倒出硅胶.（缺点费时、污染） 2、用木杆或塑料杆将硅胶一段一段地掏出 3、用真空泵, 将柱中剩余的溶剂减压抽出,在色谱柱和真空 泵之间加一个冷阱（优点：快、无污染、硅胶能迅速干燥）
2.5 检测
2.5.1 初步检测
当冲洗溶剂流出一定量后，可对流出液进行初步检测，并 且将锥形瓶更换成小试管进行收集。通常是取一小薄层板， 用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块，并按一定
的次序编号。取一根内径为0.3mm左右的玻璃毛细管蘸取 少量流出液，点于薄层板的一个小格内，待半点干后，然 后用物理的或化学的方法检测。
3、装柱 将柱底用棉花塞紧，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装 上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随 着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿） 将其冲入柱中。