大豆中β淀粉酶的提取、分离纯化、测活及固定化

大豆中β淀粉酶的提取、分离纯化、测活及固定化
组员：毛耀俊、毕蜜春、张强、陈人良、吴剑峰、罗琼、陈金德、
漆慧娟
摘要：本文通过一定的试验方法，从大豆中提取β淀粉酶，并进行分离纯化、测活以及酶的固定化，然后对结果进行分析和讨论。

关键词：大豆、β淀粉酶、分离纯化、测活、固定化
β-淀粉酶是外切型糖化酶，它作用于淀粉时，从淀粉非还原端开始水解a-1,4-糖苷键，顺次切下麦芽糖单位，遇到α-1,6键的分支点则停止不前，因此它对淀粉的水解产物是麦芽糖及大分子的β-界限糊精，该酶作用于底物时，同时发生沃尔登转位反应（Wanlden inversion），使生成的麦芽糖的由α-型转为β-型。

β-淀粉酶广布于高等植物中（如未发芽的大麦、小麦、燕麦、大豆、甘薯等）及微生物中，可耐酸。

将麦芽汁调节pH值为3.6，在0℃下可使α-淀粉酶失去活力，而余下β-淀粉酶；β-淀粉酶的唯一产物是麦芽糖，不是葡萄糖。

大豆是一年生豆科植物，呈椭圆形、球形，颜色有黄色、淡绿色、黑色等，故又有黄豆、青豆、黑豆之称。

大豆最常用来做各种豆制品、压豆油、炼酱油和提炼蛋白质。

豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料。

大豆是豆科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源。

大豆不仅含有丰富的蛋白质、脂肪，还含有丰富的β-淀粉酶。

本文主要通过一定的实验方法，从大豆中提取β-
淀粉酶，并对其进行分离提纯、测活和固定化。

1.实验材料与方法
1.1实验材料
大豆100g、0.04mol/L磷酸缓冲液、0.1mol/L磷酸缓冲溶液、NaOH溶液（2.5mol/L）、滤纸、5g淀粉、碘液、双蒸水、氯化钾溶液、豆浆机、玻璃棒、烧杯、漏斗、水浴锅、胶头滴管、滴定管、紫外分光光度计、饱和硫酸铵。

1.2实验方法
1.2.1细胞的粉碎
利用豆浆机对大豆进行植物组织细胞的破碎，得到大豆粉末。

1.2.2酶的提取
采用磷酸缓冲液按照料液比1：5混合于烧杯中，得到的混合液进行过滤(过滤2~3次)，除掉固体杂质，得到酶的粗提取液。

1.2.3酶的分离纯化
（1）对得到的粗提取液60℃水浴加热，10分钟后取出烧杯。

（2）静置5分钟，烧杯底部沉淀出大豆中含有固体杂质蛋白质，取上清液于另一烧杯中。

（3）硫酸铵进行沉淀
（4）用磷酸缓冲液对沉淀溶解得到酶的纯化液
1.2.4酶活性检测
（1）取10mL淀粉溶液于小烧杯中，并在溶液中滴入2~3滴碘液作为指示剂。

（2）将小烧杯中置于60℃水浴锅内，在小烧杯中滴入酶提取液，观察烧杯溶液中的颜色变化。

若颜色褪去，则说明酶活性存在。

1.2.5酶的活力测定
测定原理：淀粉在β-淀粉酶的催化作用下生成麦芽糖，利用麦芽糖的还原性与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，测定其吸光度，从而确定酶液中的β-淀粉酶的催化活力。

测定方法：采用DNS法，在Ph为5.8，温度为40°C的条件下，取适当稀释酶液与可溶性淀粉作用一段时间，再加入一定量的 3，5二硝基水杨酸溶于0.4mol／L的NaOH溶液中，沸水浴5min后，于波长540nm处测定吸光度值。

酶的活力定义为：在上述条件下1毫升酶液或1克酶粉，每小时产生1毫克麦芽糖的酶量为一个酶活力单位。

1.2.6酶的固定化及测活
固定化：2g海藻酸钠放入200ml的烧杯中，加蒸馏水60ml，加热溶解将浓度为5g/l的酶液加入海藻酸钠溶液中混合，再用注射器滴入1%的CaCl2溶液中，固化1h，然后过滤、洗涤、干燥，得到球状固定化酶。

测活：在盛有含碘液的淀粉溶液中放入制备好的小球状固定化酶胶粒，若溶液颜色褪去，说明酶有活性。

2.结果与分析
2.1结果
（1）小烧杯中的颜色褪去，说明酶是有活性的;
（2）酶提取液的活力为300u/mL;
（3）成功地从大豆中提取了β-淀粉酶，并将其进行了分离纯化和固定化最后得到了白色透明的球状固体;
(4)固定化酶的活力为200u/g。

2.2分析
得到的酶的活力不高，可能的原因有以下几种
（1）大豆的粉碎过程中没有完全的破坏掉细胞组织结构；
（2）在60摄氏度下进行杂志蛋白质的沉淀时，温度没有控制好，导致少量酶的失活；
（3）硫酸铵对酶的沉淀不彻底导致一些酶的流失；
（4）误将饱和硫酸铵溶液溢出的结晶当做酶一起溶解了。

3.讨论
在β-淀粉酶的提取过程中，一般黄豆β-淀粉酶的最佳提取温度为40°C，60°C以上就会失去活性；最佳PH值为5.7，PH值小于4或大于7均会使酶变性失活。

而且酶的放置时间不宜过长，时间越长酶的活力就越低。

影响酶活性的因素还有很多，如无机盐、表面活性物质、有机试剂、酸度以及还原剂等，我们以后可以往这方面去研究β-淀粉酶的活性，加深对β-淀粉酶的了解。

参考文献
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4.张剑，李睿，张开诚，张选民，周晓荣.生化方法高效提取黄豆粉中β-淀粉酶，武汉工业学院化学与环境工程系，2010.07
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