DNA序列测定的原理和方法
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DNA序列测定的原理和方法 DNA序列测定的原理和方法
郭 鹏 2003.10.05
方法
双脱氧链终止法（ 双脱氧链终止法（Sanger法）和化 法 学降解法（ 学降解法（Maxam-Gilbert法） 法
双脱氧链终止法 双脱氧链终止法
双脱氧链终止法的测序原理
双脱氧链终止法的测序 基础是以双脱氧核苷三磷 酸(ddNTP)为循环测序反 为循环测序反 应的链终止剂。 应的链终止剂。
二氯罗丹明 受体染料
计算机
激光扫描镜头
计算机
循环测序反应（Cycle Sequencing Reactions） Reactions） 循环测序反应（ 简便、快速、结果准确可靠。 简便、快速、结果准确可靠。 安全、无污染。 安全、无污染。 模板用量大大减少。单链DNA模板用量为 模板用量为50-100ng， 模板用量大大减少。单链 模板用量为 ， 双链DNA模板则为 模板则为200-500ng，PCR产物为每 产物为每100bp 双链 模板则为 ， 产物为每 仅需2-5ng。 仅需 。 测序能力增强，测序长度大大提高。 测序能力增强，测序长度大大提高。具有一次扫描 可检测多种荧光的特点，测序速度可高达200bp/小 可检测多种荧光的特点，测序速度可高达 小 此外，一个样品一次可测定800-1200个碱基， 个碱基， 时，此外，一个样品一次可测定 个碱基 而同位素一次只能测定200-300个碱基。 个碱基。 而同位素一次只能测定 个碱基
Thank you
BigDye Terminators的基本原理与测序步骤 Terminators的基本原理与测序步骤
原 理
终止 ddNTP
核苷酸链
延伸 dNTP
图3 循环测序反应原理示意图
循环测序反应产物的纯化
电泳与结果分析
循环测序 反应产物
沉淀
洗涤பைடு நூலகம்
除BigDye Terminators
测序仪氩离子 激光能量 氢化荧光素 供体染料
图1 脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
BigDye Terminators
BigDye Terminators由三部分组成： 由三部分组成： 由三部分组成 ddNTP+氢化荧光素供体染料 二氯罗丹明受 氢化荧光素供体染料+二氯罗丹明受 氢化荧光素供体染料 体染料，其中， 体染料，其中，前两者通过核苷酸连接器链 接，后两者则通过单分子能量转移连接器链 接，每种标记染料的最大激发为氢化荧光素 供体，而发射光谱则为二氯罗丹明受体（ 供体，而发射光谱则为二氯罗丹明受体（图 2）。由于使用了四色荧光分别标记了四种 ）。由于使用了四色荧光分别标记了四种 ）。 ddNTPs，可按照四种不同荧光来分别识别 、 ，可按照四种不同荧光来分别识别A、 T、G、C，因此，可在一个反应管中完成循 、 、 ，因此， 环测序反应， 环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完 成测序任务。 成测序任务。 图2. BigDye Terminators
富含GC模板 模板 富含
富含GC的模板，易产生发夹结构，无法完成循环测序反应。 的模板，易产生发夹结构，无法完成循环测序反应。 富含 的模板 主要有以下解决办法： 主要有以下解决办法： 在反应体系中加入5-10%（v/v）的DMSO（二甲基亚砜）； 在反应体系中加入 （ ） （二甲基亚砜）； 改变循环条件—在循环之前先将 改变循环条件 在循环之前先将DNA于96℃预变性，其时 在循环之前先将 于 ℃预变性， 间长短视具体情况而定，同时， 间长短视具体情况而定，同时，将循环的变性温度提高至 98℃； ℃ 换用其它测序试剂盒， 换用其它测序试剂盒，如dRhodamine Teriminators试剂盒 试剂盒 等。 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时， 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时，应将 其构建成较小的DNA片段克隆，以降低 片段克隆， 模板GC含量 含量。 其构建成较小的 片段克隆 以降低DNA模板 含量。 模板
影响DNA测序的因素 影响DNA测序的因素
待测DNA模板质量 模板质量 待测
待测DNA模板的浓度与纯度，以及在循环测序反应中的终浓度 模板的浓度与纯度， 待测 模板的浓度与纯度 是其测序成功与否的前提条件，也是最易出现问题的环节。 是其测序成功与否的前提条件，也是最易出现问题的环节。 PCR产物及质粒 产物及质粒DNA模板是最常见的科研用测序 模板是最常见的科研用测序DNA模板。模 模板。 产物及质粒 模板是最常见的科研用测序 模板 板纯化后，一般可采用琼脂糖凝胶电泳或DNA定量仪对其浓度 板纯化后，一般可采用琼脂糖凝胶电泳或 定量仪对其浓度 与纯度进行进一步的鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定时， 与纯度进行进一步的鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定时，要求条带 清晰、无杂带、无拖尾；此外，可根据DNA Marker进行粗略 清晰、无杂带、无拖尾；此外，可根据 进行粗略 定量。 定量仪鉴定时， 定量。DNA定量仪鉴定时，要求模板的纯度达到 定量仪鉴定时 要求模板的纯度达到A260/A280在 在 1.70~1.90，最好为 ，最好为1.80，因为当 ，因为当A260/A280＞1.90时，表明 ＞ 时 表明RNA 含量过高， 含量过高，而A260/A280＜1.70，表明蛋白质含量过高，均会 ＜ ，表明蛋白质含量过高， 对结果造成影响。未达到上述要求的样品，均应立即纯化， 对结果造成影响。未达到上述要求的样品，均应立即纯化，以 保证测序结果。 保证测序结果。
循环测序反应条件
引物设计
由于循环测序反应的特殊要求，普通 由于循环测序反应的特殊要求，普通PCR反应中可成 反应中可成 功地特异、高效扩增目的DNA片段的 片段的PCR引物并不一定总是 功地特异、高效扩增目的 片段的 引物并不一定总是 适合作为循环测序反应的引物。 适合作为循环测序反应的引物。循环测序反应的引物应当具 有适当的Tm值。由于 有适当的 值 由于BigDye Terminators试剂盒循环测序反 试剂盒循环测序反 应中的退火条件为50℃ 应中的退火条件为 ℃10sec，因此，一般要求引物的 ，因此，一般要求引物的Tm值 值 至少＞ ℃ 一般以52℃ ℃为宜，但不能＞ ℃ 至少＞50℃，一般以 ℃-58℃为宜，但不能＞65℃。对于 Tm值的估计，可借助于一些引物设计软件，也可手工 值的估计， 值的估计 可借助于一些引物设计软件， Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算， 来粗略估算， 来粗略估算
郭 鹏 2003.10.05
方法
双脱氧链终止法（ 双脱氧链终止法（Sanger法）和化 法 学降解法（ 学降解法（Maxam-Gilbert法） 法
双脱氧链终止法 双脱氧链终止法
双脱氧链终止法的测序原理
双脱氧链终止法的测序 基础是以双脱氧核苷三磷 酸(ddNTP)为循环测序反 为循环测序反 应的链终止剂。 应的链终止剂。
二氯罗丹明 受体染料
计算机
激光扫描镜头
计算机
循环测序反应（Cycle Sequencing Reactions） Reactions） 循环测序反应（ 简便、快速、结果准确可靠。 简便、快速、结果准确可靠。 安全、无污染。 安全、无污染。 模板用量大大减少。单链DNA模板用量为 模板用量为50-100ng， 模板用量大大减少。单链 模板用量为 ， 双链DNA模板则为 模板则为200-500ng，PCR产物为每 产物为每100bp 双链 模板则为 ， 产物为每 仅需2-5ng。 仅需 。 测序能力增强，测序长度大大提高。 测序能力增强，测序长度大大提高。具有一次扫描 可检测多种荧光的特点，测序速度可高达200bp/小 可检测多种荧光的特点，测序速度可高达 小 此外，一个样品一次可测定800-1200个碱基， 个碱基， 时，此外，一个样品一次可测定 个碱基 而同位素一次只能测定200-300个碱基。 个碱基。 而同位素一次只能测定 个碱基
Thank you
BigDye Terminators的基本原理与测序步骤 Terminators的基本原理与测序步骤
原 理
终止 ddNTP
核苷酸链
延伸 dNTP
图3 循环测序反应原理示意图
循环测序反应产物的纯化
电泳与结果分析
循环测序 反应产物
沉淀
洗涤பைடு நூலகம்
除BigDye Terminators
测序仪氩离子 激光能量 氢化荧光素 供体染料
图1 脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
BigDye Terminators
BigDye Terminators由三部分组成： 由三部分组成： 由三部分组成 ddNTP+氢化荧光素供体染料 二氯罗丹明受 氢化荧光素供体染料+二氯罗丹明受 氢化荧光素供体染料 体染料，其中， 体染料，其中，前两者通过核苷酸连接器链 接，后两者则通过单分子能量转移连接器链 接，每种标记染料的最大激发为氢化荧光素 供体，而发射光谱则为二氯罗丹明受体（ 供体，而发射光谱则为二氯罗丹明受体（图 2）。由于使用了四色荧光分别标记了四种 ）。由于使用了四色荧光分别标记了四种 ）。 ddNTPs，可按照四种不同荧光来分别识别 、 ，可按照四种不同荧光来分别识别A、 T、G、C，因此，可在一个反应管中完成循 、 、 ，因此， 环测序反应， 环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完 成测序任务。 成测序任务。 图2. BigDye Terminators
富含GC模板 模板 富含
富含GC的模板，易产生发夹结构，无法完成循环测序反应。 的模板，易产生发夹结构，无法完成循环测序反应。 富含 的模板 主要有以下解决办法： 主要有以下解决办法： 在反应体系中加入5-10%（v/v）的DMSO（二甲基亚砜）； 在反应体系中加入 （ ） （二甲基亚砜）； 改变循环条件—在循环之前先将 改变循环条件 在循环之前先将DNA于96℃预变性，其时 在循环之前先将 于 ℃预变性， 间长短视具体情况而定，同时， 间长短视具体情况而定，同时，将循环的变性温度提高至 98℃； ℃ 换用其它测序试剂盒， 换用其它测序试剂盒，如dRhodamine Teriminators试剂盒 试剂盒 等。 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时， 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时，应将 其构建成较小的DNA片段克隆，以降低 片段克隆， 模板GC含量 含量。 其构建成较小的 片段克隆 以降低DNA模板 含量。 模板
影响DNA测序的因素 影响DNA测序的因素
待测DNA模板质量 模板质量 待测
待测DNA模板的浓度与纯度，以及在循环测序反应中的终浓度 模板的浓度与纯度， 待测 模板的浓度与纯度 是其测序成功与否的前提条件，也是最易出现问题的环节。 是其测序成功与否的前提条件，也是最易出现问题的环节。 PCR产物及质粒 产物及质粒DNA模板是最常见的科研用测序 模板是最常见的科研用测序DNA模板。模 模板。 产物及质粒 模板是最常见的科研用测序 模板 板纯化后，一般可采用琼脂糖凝胶电泳或DNA定量仪对其浓度 板纯化后，一般可采用琼脂糖凝胶电泳或 定量仪对其浓度 与纯度进行进一步的鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定时， 与纯度进行进一步的鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定时，要求条带 清晰、无杂带、无拖尾；此外，可根据DNA Marker进行粗略 清晰、无杂带、无拖尾；此外，可根据 进行粗略 定量。 定量仪鉴定时， 定量。DNA定量仪鉴定时，要求模板的纯度达到 定量仪鉴定时 要求模板的纯度达到A260/A280在 在 1.70~1.90，最好为 ，最好为1.80，因为当 ，因为当A260/A280＞1.90时，表明 ＞ 时 表明RNA 含量过高， 含量过高，而A260/A280＜1.70，表明蛋白质含量过高，均会 ＜ ，表明蛋白质含量过高， 对结果造成影响。未达到上述要求的样品，均应立即纯化， 对结果造成影响。未达到上述要求的样品，均应立即纯化，以 保证测序结果。 保证测序结果。
循环测序反应条件
引物设计
由于循环测序反应的特殊要求，普通 由于循环测序反应的特殊要求，普通PCR反应中可成 反应中可成 功地特异、高效扩增目的DNA片段的 片段的PCR引物并不一定总是 功地特异、高效扩增目的 片段的 引物并不一定总是 适合作为循环测序反应的引物。 适合作为循环测序反应的引物。循环测序反应的引物应当具 有适当的Tm值。由于 有适当的 值 由于BigDye Terminators试剂盒循环测序反 试剂盒循环测序反 应中的退火条件为50℃ 应中的退火条件为 ℃10sec，因此，一般要求引物的 ，因此，一般要求引物的Tm值 值 至少＞ ℃ 一般以52℃ ℃为宜，但不能＞ ℃ 至少＞50℃，一般以 ℃-58℃为宜，但不能＞65℃。对于 Tm值的估计，可借助于一些引物设计软件，也可手工 值的估计， 值的估计 可借助于一些引物设计软件， Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算， 来粗略估算， 来粗略估算