心肌纤维化相关生物标志物

Dean等(2005)在大鼠心梗模型中发现
◦ CTGF mRNA和蛋白表达高峰出现在心肌梗死后180天， 表达部位在存活的心肌组织，提示CTGF可能主要与后期 的心脏纤维化有关。
Ahmed等(2004) 在AngII致心肌纤维化模型发现
◦ CTGF起关键作用，通过AT1受体阻滞剂则可以下调TGFβ1的表达而改善纤维化程度。
PDGFs是一种促进成纤维细胞及血管平滑肌细胞有
丝分裂和趋化的细胞因子。
◦ PDGFs高表达导致心肌纤维化的发生(Ponten等.2005)。 ◦ 通过对靶基因敲减或过表达研究(Zymek等.2006)等发现，
PDGFs致心肌纤维化主要通过活化其受体酪氨酸激酶，起动第二信 使级联放大作用，以自分泌和旁分泌的形式与其它生长因子协同作 用，如TGF-β1。
◦ I型约占心肌胶原总数80%，纤维粗，有较大僵硬度和很强 的抗牵拉性；
◦ III型约占11%，纤维较细，伸展性和弹性大，保持室壁弹 性；
➢ 细胞外基质(extracellular matrix，ECM)
心肌纤维化过程中心脏成纤维细胞增殖并向肌成纤维细 胞表型转化，合成过量胶原等ECM成分，同时ECM降 解减少。
心肌纤维化：是指心肌组织中细胞外基质 过量沉积，胶原浓度和胶原容积(CVF)显著 增加，各型胶原比例失调以及排列紊乱。
➢ 心肌纤维化(myocardialfibrosis，MF) ➢ 胶原容积(collagenvolumefraction，CVF)
心肌纤维化在多种心血管疾病中存在，与 高血压病、心肌梗死及心力衰竭、风湿性 心脏病、心房颤动、糖尿病性心肌病变等 疾病相关，是心源性猝死的潜在危险因素。
各类细胞因子、炎症因子和氧化应激均可能促进成 纤维细胞增殖、合成大量胶原，导致纤维化，而细 胞纤维化可以促进细胞因子的分泌。目前研究主要 集中在以下几种。
◦ (一)结缔组织生长因子(CTGF) ◦ (二)转化生长因子β(TGF-β) ◦ (三)血小板衍生生长因子 ◦ (四)炎症因子
CTGF是在1991年，首先由Bradham等在血小板衍生 生长F是高度保守的 CCN(connective-tissue-growth-factor，cysteinerich protein-61，nephroblastoma-over-expressed) 多肽家族成员，促进成纤维细胞分裂和胶原沉积，与多 种器官纤维化的发生发展关系密切。
Batlle等(2007)比较特发性扩张型心肌病重症心力衰竭患者 和心脏移植供者的心脏，发现前者MMP-2的表达水平和心脏 纤维化水平相关，提示MMP-2可能参与了充血性心力衰竭患 者的心脏纤维化全过程。
Martos等进一步证实舒张性心力衰竭的患者中MMP-2和 MMP-9水平较对照组升高，舒张功能不全较严重的患者 TIMP水平越高，而血清学证据提示舒张性心力衰竭患者的 ECM胶原代谢水平增加，二者结果相匹配，说明其预测纤维 化作用与胶原代谢产物相当。
Querejeta等(2000)提出ICTP为心肌纤维化的标志物。
◦ 动物实验证明，循环中胶原代谢的循环标志物与心肌纤维化明 显相关。活检发现，ICTP与心脏局部I、III型胶原的沉积显著相 关，可作为体内心肌纤维化的非侵入性评估方法。
Querejeta等(2004)通过对高血压性心脏病病人的研究 发现，
成纤维细胞表型转化后，表达数种特异性平滑肌标记性 分子，如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌 22α(SM22α)、平滑肌肌球蛋白重链胚胎型(SMemb)以 及原肌凝蛋白，从血中检测以上指标可能发掘新的心肌 纤维化标记物。
在生理情况下，
◦ 只有小部分的前肽胶原被用来维持已有的胶原结构， ◦ 大部分的前胶原肽被合成和分泌后，迅速降解，一些包含
Dean等在大鼠心梗模型中，发现
◦ TGF-β1mRNA和蛋白表达在心肌梗死后1周升高最明显，主要表达 在梗死灶的边缘区域及瘢痕形成处，此种不同时间及心脏不同部位 表达的差异性提示TGF-β1主要参与心肌梗死急性期炎性反应和损 伤修复。
近年新发现的生长分化因子-15(GDF-15)是TGF-β 超家族成员之一，参与心血管疾病的发生发展过程， 在心肌急性缺血和缺血-再灌注损伤、心肌肥厚及心 力衰竭等病理过程中表达水平增高，发挥保护性作 用。目前临床资料提示它与胶原代谢相关，故可能 成为一个新的预测或减少心肌纤维化的重要因子。
仅仅通过胶原代谢产物血清学相关指标还不足够诊断心 肌纤维化
◦ 血清胶原代谢相关产物在肝脏、肺脏、肾脏等脏器纤维化时同 样表达升高，曾有研究把ICTP、PIIINP作为肝纤维化的标志物。
基质金属蛋白酶(MMPs)是参与降解细胞外基质的 最重要酶系，也包括降解基质胶原的作用，分为四 大类20多个成员；
胶原蛋白前肽的氨基或羧基末端片断在此过程中被释放入 血。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
胶原代谢的循环标志物水平被认为是I、III型胶原合成的 间接标志。
目前循环中可测定的胶原肽段成分包括，
◦ I型前胶原氨基端肽(PINP)：反映I型胶原合成速率。 ◦ I型前胶原羧基端肽(PICP)， ◦ I型胶原羧基端肽(ICTP)：反映I型胶原降解速率。 ◦ III型前胶原氨基端肽(PIIINP)：综合反应III型胶原转换。 ◦ ……
心力衰竭晚期，神经体液调节异常激活MMPs，介导炎症因子活化，刺 激成纤维细胞、内皮细胞合成及分泌基质物质，释放入血；且MMPs引 起TIMPs反应性增加。TIMPs抑制MMPs，使胶原、血清透明质酸及层粘 连蛋白等间质物质降解减少；细胞外间质物质堆积增加，并释放入血， 使外周血中胶原、血清透明质酸及层粘连蛋白等间质物质浓度进一步增 加。
测炎性因子(尤其是TNF-α和IL-6)可直接反映促心肌纤维化因素，但因 其作用广泛，受全身因素影响，特异性欠佳，发掘一个特异的反映心
肌纤维化的炎性因子更有助诊断。
MicroRNA(miRNA)是一类长约19～24核苷酸的非 编码RNA，绝大多数miRNA通过与靶基因3‘-UTR 区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细 胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育，参 与多种疾病过程。
◦ 大量的横断面研究和前瞻性研究都已经证实了CTGF作为心肌纤维 化标志物的价值。
TGF-β与心肌纤维化密切相关。TGF-β参与调节成纤维细胞 的增殖、转化、迁移和细胞外基质的产生。
NAD(P)H氧化酶通过调节Smad2/3的活化来介导TGF-β1诱 导人心脏成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，从而在心肌纤维 化起重要作用。
PDGFs在体内还可以改变纤维母细胞的形态，诱导胶原的合成与增 殖。
➢ 血小板衍生生长因子(platelet derived growth factors，PDGFs)
炎性因子在多种疾病所致的心脏纤维化进程中有重要作用。 实验发现急性心肌梗死早期炎性细胞因子合成和释放增加，包括肿瘤坏
死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素1β(IL-1β)；给予醛 固酮处理4～5周，左、右心室壁中无论是血管损伤还是非损伤部位，均 出现巨噬细胞、T淋巴细胞浸润，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、细胞间 黏附分子1(ICAM-1)、TNF-α等炎性因子表达增加。 炎性细胞和炎性因子表达量和活性增强，促进静止状态的成纤维细胞增 殖，且促进其转化为肌成纤维细胞，增加胶原沉积，导致心肌纤维化。 炎性因子在此过程中形成复杂的调节网络，互相促进导致恶性循环，检
基质金属蛋白酶( MMP) 是一组锌离子依赖性内肽酶，包括多个结构相似、 能够消化基质和基膜的酶，目前至少已确定了18 种。
根据结构域及酶与底物亲和力的不同分为
◦ 胶原酶 ◦ 明胶酶 ◦ 间质溶解酶 ◦ 膜型金属蛋白酶。
MMP 表达下调和酶激活过度受抑，可能参与了许多表现为ECM 过多沉 积的病理过程( 如动脉粥样硬化、多种结缔组织疾病和重要脏器纤维化形 成过程等) 。此外，细胞外基质金属蛋白酶诱导物( EMM-PRIN) ，具有 诱导MMP 基因表达的作用。
Koitabashi等在舒张性心功能不全MF改变的研究中发现，
◦ 严重MF和舒张性心力衰竭使心肌细胞的CTGF表达异常增多。
Koitabashi在2008年提出可以用血浆中CTGF的水平作为心 力衰竭的标志物。
◦ 研究发现，血浆CTGF水平与血浆BNP、TGF-β、MMP2和TIMP-2
相关。尽管CTGF在全身均有表达，不能作为心肌纤维化特异标志 物，但它可以作为一种纤维化预后和器官受损的标志物。
第二种是原生质膜上由膜型MMP 所介导，这一机制被认为在细胞 转移、降解细胞周围基质过程中起着重要作用;
第三种是细胞内激活。文献也证实MT-MMP 也存在着细胞内激活， 但其机制有待进一步研究。
浅论基质金属蛋白酶与心肌纤维化
心肌缺血及梗死导致神经体液异常，刺激心肌细胞、成纤维细胞、肌成 纤维细胞合成分泌MMPs。MMPs被丝氨酸蛋白酶、纤溶酶、胰蛋白酶、 弹性蛋白酶、激肽及组织蛋白酶G等激活后降解基质胶原，使心肌失去基 质胶原支持并出现排列紊乱。血清及心肌MMPs活性增加与心室重构、 左心室扩大有相关性(Yan等.2005，Yamazaki等.2004)。
浅论基质金属蛋白酶与心肌纤维化
MMP 主要以酶原的形式分泌到细胞外，需经过蛋白酶的水解才能 活化，已发现MMP 有3 种不同的激活方式，
第一种是细胞外由血清蛋白酶所介导，即通过丝氨酸蛋白酶( 如血 清酶、胰蛋白酶、尿激酶等) 分解酶原，使金属蛋白酶中半胱氨酸 序列的Zn-Cys 断裂而具有部分活性，再通过别的金属蛋白酶如 MMP-3 进一步分解，形成具有完全活性的MMP;
生物标志物：一般指循环中反映生物体系与环境 因子相互作用引起的生理、生化、免疫和遗传等 多方面分子水平改变的物质。
一个好的生物标志物具备检测方法简易、提供更 多临床信息、指导临床诊疗等特征。
通过对血液中某些生物标志物的检测，可望实现 对心肌纤维化的早期发现、早期干预。
由此，研究和发现心肌纤维化的生物标志物已成 为热点关注的科学问题
➢ UTR（Untranslated Regions)即非翻译区，是信使RNA（mRNA）分子两 端的非编5261码片段。
➢ 5‘-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子， ➢ 3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的末端。
目前发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA 分子近700种，其中绝大部分的miRNA分子在不同 病理和生理状况下表达，多数miRNA可在人体液中 检出。随着检测技术的进步，循环miRNA在疾病诊 断中的应用研究，尤其是在肿瘤诊断和预后等领域 有了实质性进展。
组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)是MMPs的内源性 特异性抑制物，分为TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、 TIMP-4。
➢ 基质金属蛋白酶(metrix metalloproteinase，MMPs) ➢ 组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)
◦ I型胶原合成和沉积增加促进高血压心衰患者的心肌纤维化，心 脏分泌磷脂酰肌醇磷酸经冠状窦入外周血循环，从人群水平证 明外周血指标可作为心肌纤维化的标志物。
Martos等证实
◦ 舒张性心力衰竭患者ICTP、PINP、PIIINP水平升高，血清学证 据提示此类患者的细胞外基质胶原代谢水平增加，且在舒张功 能不全严重的患者中纤维化程度更显著。
根据纤维化的机制，将相关的标志物大致分四类:
◦ (1)胶原合成相关标志物； ◦ (2)胶原降解相关标志物； ◦ (3)胶原代谢相关细胞因子； ◦ (4)胶原基因转录相关的MicroRNA
检测心肌组织中胶原浓度和胶原容积是界定心肌纤 维化的金标准。
心脏的细胞外基质(ECM)主要由I、III型胶原纤维组 成，还有少量IV型、V型、VI型胶原。