血清谷丙转氨酶活性的测定

2．GPT底物液
称取分析纯L-丙氨酸1.78g,α-酮戊二酸29.2mg,先用 50mL磷酸盐缓冲液溶解,然后用1mol/L NaOH校正pH 至7.4（约0.5mL）,再加磷酸盐缓冲液至100ml,加氯仿 数滴，防止变质。
3．2.0mmol/L丙酮酸标准液 4．0.4mol/L NaOH溶液 5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液
【实验原理】
ALT催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移,生成丙酮 酸和谷氨酸,生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸 2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显红棕色，颜色的深浅与丙酮酸 含量成正比。根据丙酮酸的生成量，即可计算GPT活性的大小。 α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼反应生成相应的苯腙， 在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在520nm处 比色时，丙酮酸2,4-二硝基苯腙的光密度远比α-酮戊二酸苯腙 高。反应30min后， α-酮戊二酸量减少而丙酮酸量增加 ，在 一定范围内，520nm处光密度增加的程度与反应体系中丙酮酸 和α-酮戊二酸的摩尔比例呈线性关系。
【目的要求】
1.了解血清谷丙转氨酶活力单位的定义。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活力测定的具体操作方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活力测定的临床意义。
GPT酶活力单位
卡门首先研究了GPT酶活力的测定方法，并定义了
酶的活力单位。 原理
活力单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）,在25℃1min中内生成的 丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+,在340nm处， 用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基酸转移酶活 力单位。
【操作步骤】
标准曲线绘制 取试管5支，按下表操作
试剂(ml) 0 1 2 3 4
丙酮酸标准液
GPT底物液 磷酸盐缓冲液
0.00
0.50 0.10
0.05
0.45 0.10
0.10
0.40 0.10
0.15
0.35 0.10
0.20
0.30 0.10
2，4-二硝基苯肼溶液
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
混匀，37℃保温20min
NaOH溶液 相当于GPT活性/卡门单位
5.00
0
5.00
28
5.00
57
5.00
97
5.00
150
混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，用520nm波长比色，读取各管光密度。各管的吸光度 An减去0管的吸光度A0，然后以差值为纵坐标，酶活力单位为横坐标，绘制标准曲线。
酶活力的测定
取试管两支，注明测定管（T）和对照管（C），将底物液在37℃水浴中
预温5min,z再按下表操作
试剂/mL 血清 GPT底物液
测定管（T） 0.10 0.50
对照管（C） 0.50
混匀，37℃水浴30min
2，4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5
混匀，37℃水浴20min
血清 0.4mmol/L NaOH 5.00 0.10 5.00
丙氨酸+ α-酮戊二酸
ALT
丙酮酸+谷氨酸
2,4-二硝基苯肼
α-酮戊二酸-2,4-二硝基苯腙 丙酮酸-2,4-二硝基苯腙
0. 4mol/LNaOH
红棕色 红棕色（三倍）
【实验仪器】
试管 微量可调式移液器 5mL移液管 721E分光光度计 37℃恒盐缓冲液（pH7.4）
混匀，室温放置10min后，蒸馏水调零，在波长为520nm处 比色，读取吸光度。用AT-AC查标准曲线，即可得到血清中 ALT的活性。
【临床意义】
肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞 受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活 性增高。测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 1.ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞 坏死。 2.中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌 梗塞。 3.轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼 肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。

【思考题 】
1改良赖式法用终止法测定GPT活性，本实验是如何终止酶 促反应的？ 加入NaOH溶液使酶失去活性 2.比较赖式法和卡门法的原理，说明两种方法的联系与区 别. 联系：都用偶联酶反应定量法
都是通过测定吸光度间接得到GPT活性
都是用同一酶单位定义 区别：
3.若用标准对照法完成此实验，试设计实验步骤
血清谷丙转氨酶活性的测定（改良 赖式法）
第八组 刘坪 田海兵 凯依赛尔
谷丙转氨酶（GPT）
氨基转移酶也称为转氨酶。是催化把α-氨基酸上的
氨基转移给α-酮酸形成新的酮酸和氨基酸反应的酶 类，如血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶。 谷丙转氨酶，简称GPT（全名谷氨酸-丙酮酸转氨酶, 简称ALT）GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重 要指标。在常见的因素里，各类肝炎都可以引起 GPT升高，这是由于肝脏受到破坏所造成的。