纤维素分解菌的分离和鉴定

纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验

一、实验背景

纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。

二、实验目的

从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。

三、实验材料：

1、样品的采集

1）风干土样E4-1、E2-6、 E2-6试样。

2）潮湿土样E4-1、E2-6、 E2-6试样。

3）牛粪样品2份

以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；

2、培养基

1）CMC培养基

2）LB培养基

3）高氏1号培养基

4）PDA培养基

3、其他物品

天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无

菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿， 1ml及0.08ml移液管。四、实验步骤：

（牛粪中纤维素降解菌类的分离与鉴定）

牛粪取样选择培养挑菌保种刚果红鉴定

1、牛粪取样

于冰箱取2个牛粪样品各5g。

2、选择培养

（1）实验准备：将实验所需平板约60个，两个锥形瓶（各45ml无菌水加少量

玻珠），14支9ml无菌水灭菌。

（2）培养基的配置：参照配方配制培养基①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基

③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。

（3）将2份牛粪样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内，即为10-1悬液，于1500r/min摇床15min。

（4）用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中，即为10-2悬液，如此重复，

依次制成10-3至10-8悬液。

（5）倒平板：将灭菌后的各个培养基在无菌操作下倒20ml左右于培养基中，凝

固后待用。

（6）涂布平板：将稀释度为10-6至10-8悬液各取0.08ml涂布到平板培养基上，

每个梯度需涂布2个平板，设为对照。置于培养箱中培养观察，持续观察，直到

出现明显的菌落。

3、挑菌保种

将出来的明显菌类按照类别分别保种到不同的斜面培养基中。

4、刚果红鉴定

配制刚果红培养基，将菌株点样与刚果红培养基上，置于培养箱培养。观察各个菌株是否具有分解纤维素的能力。

（从湿土中提取纤维素菌）

1、分别配制①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基④PDA培养基各500ml，装进5个瓶子中。在14根试管中分别加入9ml蒸馏水，并用试管塞塞紧。在两个锥形瓶中分别加入45ml蒸馏水，并且放如玻璃球，用封口膜封好。包90个平板。准备1ml和0.1ml移液枪的枪头。将以上5种物品用报纸包好后放入灭菌锅中121℃灭菌30分钟。同时将操作台的紫外线打开。

2、待灭菌完后，将物品取出，放入烘箱烘干。

3、将烘干后的平板、试管、锥形瓶、枪头放入操作台里。两种湿土样分别称取5g，在操作台里加到锥形瓶中，封口，放到摇床上摇30分钟。

4、摇好后取回，关闭操作台的紫外线。取7支试管并分别标号-2、-3、-4、-

5、-

6、-7，用1ml移液枪从一个锥形瓶中吸取1ml菌液，射到-2号试管中，换枪头，从-2号试管中吸取1ml菌液射到-3号试管中，以此类推。另一个锥形瓶的菌液也要经过同样的操作。

5、取一个培养基（例如LB培养基），倒24个平板，立即用1ml移液枪移取一种菌液-5号试管中的液体，注射到一个平板中，摇匀（混菌法）。标号。一个菌液，一个梯度做两个平板.剩下12个平板做涂布。其他4个培养基同理。

6、待要涂布的平板干了以后，进行涂布。每个平板加0.1ml菌液，用涂布器抹匀，到看不见水印为止，将涂布完的平板倒置在超净台里。标号。一个菌液，一个梯度做两个平板。

7、将做好的所有平板，放入恒温箱中培养，每天观察有没有长菌，及时将有菌的平板挑出保种。

（从干土中提取纤维素菌）

1、土壤处理

于冰箱取3个土壤样品置于实验室中风干7天左右。

2、选择培养

（1）实验准备：将实验所需平板约90个，两个锥形瓶（各45ml无菌水加少量玻珠），21支9ml无菌水灭菌。

（2）培养基的配置：参照配方配制培养基：①羧甲基纤维素钠培养基②LB培养基③高氏一号培养基。在121℃下高压灭菌20min。

（3）将3份土壤样品于超净工作台内放入45ml锥形瓶内，即为10-1悬液，于1500r/min摇床15min。

（4）用移液枪吸取10-1悬液1ml打入9ml无菌水中，即为10-2悬液，如此重复，依次制成10-3至10-8悬液。

（5）倒平板：将灭菌后的各个培养基在无菌操作下倒20ml左右于培养基中，凝固后待用。

（6）涂布平板：将稀释度为10-6至10-8悬液各取0.08ml涂布到平板培养基上，每个梯度需涂布2个平板，设为对照。置于培养箱中培养观察，持续观察，直到出现明显的菌落。

3、挑菌保种

将出来的明显菌类按照类别分别保种到不同的斜面培养基中。

4、刚果红鉴定

配制刚果红培养基，将菌株点样与刚果红培养基上，置于培养箱培养。观察各个菌株是否具有分解纤维素的能力。