抗生素类药物分析

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第十一章抗生素类药物分析

基本要求

学习要点

内容

第一节概述

一、特点：化学纯度较低, 同系物多，异构体多，降解物多，稳定性差。

二、鉴别方法：生物学法，理化方法。

三、特殊检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌，组分分析，聚合物等。

四、含量测定或效价测定

(一)、微生物学法——通过比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小来测定供试品的效价。其原理恰好与临床应用要求一致，更能确定抗生素的医疗价值。

1、对于分子结构复杂、多组分的抗生素，生物学法是首选的效价测定方法。

2、本法的优点：

灵敏、用量小，结果直观

适用范围广：纯度好的、差的制品，已知或新发现的抗生素均适用，同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价。

3、缺点：

操作步骤多，测定时间长，误差大等。

(二)、理化方法——适用于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素。

1、本法的优点：

迅速、准确、有较高的专属性。

2、缺点：

对含有具同样官能团杂质的供试品不适用，或需采取适当方法加以校正。而且当该法是利用某一类型抗生素的共同结构部分的反应时，所测得的结果，往往只能代表药物的总的含量，并不一定能代表抗生素的生物效价。

第二节β-内酰胺类抗生素

一、化学结构与性质

(一)、青霉素族

(二)、头孢菌素族

二、鉴别试验

(一)、呈色反应

1、羟肟酸铁反应青霉素及头孢菌素在碱性中与羟胺作用，β-内酰胺环破裂生成羟肟酸；在稀酸中与高铁离子呈色。

2、茚三酮反应

3、与重氮苯磺酸的偶合反应

4、硫酸-甲醛试验

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(二)、各种盐的反应

1、钾、钠离子的火焰反应

2、有机胺盐的特殊反应（如普鲁卡因青霉素的重氮化-偶合反应）

(三)、色谱法

1、高效液相色谱法（HPLC）

2、薄层色谱法（TLC）

3、中国药典收载的头孢菌素族药物和大多数青霉素族药物采用HPLC法进行鉴别。

(四)、光谱法

1、IR——各国药典对收载的β-内酰胺类抗生素几乎均采用了本法进行鉴别。

2、该类抗生素共有的特征峰：

1)、β－内酰胺环羰基的伸缩振动（1750～1800）

2)、仲酰胺的氨基、羰基的伸缩振动（3300cm-1±，1525 cm-1±，1680 cm-1±）

3)、羧酸离子的伸缩振动（1600 cm-1±、1410 cm-1±）

3、UV——利用最大吸收波长鉴定法或利用水解产物的最大吸收波长鉴定法。

三、特殊杂质的检查

本类抗生素的特殊杂质主要有高分子聚合物，有关物质，异构体等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用测定杂质的吸收度来控制杂质量的。

(一)、聚合物——HPLC法

1、色谱条件与系统适用性试验用葡聚糖凝胶G-10（40～120?m）为填充剂，玻璃柱内径1.3～1.5cm，床体积50～60mL；流动相A为含3.5%硫酸铵的0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸氢二钠2.19g和磷酸二氢钠0.54g，加水1000mL使溶解，调节pH值至7.0），流动相B为0.01%十二烷基硫酸钠溶液；流速为每分钟1mL；检测波长为254nm。以流动相A为流动相，用1mg/mL

蓝色葡聚糖2000溶液进样200?L进行测定，理论板数应不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，对照品溶液以流动相B为流动相，重复进样200?L，峰面积值的相对标准差应小于5.0%。

2、对照品溶液的制备取头孢他啶对照品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶

100ug/1mL的溶液，摇匀。

3、测定法取本品适量，精密称定，加水制成含头孢他啶20mg/1mL的溶液，立即进样200uL，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图；另取对照品溶液200uL注入液相色谱仪，以流动相B为流动相，记录色谱图，按外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得过0.3%。

4、自身对照外标法的原理：

1)、该法是利用特定条件下β-内酰胺类抗生素可以缔合成与高分子杂质有相似色谱行为的缔合物，即在Kav=0处表现为单一的色谱峰。

2)、以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；

3)、然后改变色谱条件，测定样品，记录样品色谱图中Kav=0处的高分子杂质峰的响应指标，

4)、按外标法计算，即得样品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。

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(二)、有关物质和异构体

1、例1 头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查：

>>色谱条件与系统适用性试验：要求头孢呋辛酯A，B异构体之间、头孢呋辛酯A异构体与头孢呋辛酯△2-异构体之间的分离度R﹥1.5；理论板数按头孢呋辛酯A异构体峰计算，n ≥1500。

>>异构体——照含量测定项下方法试验。以A异构体峰的相对tR为1.0，B异构体峰的相对tR约为0.85，

>>供试品色谱图中A异构体峰的面积与A、B异构体峰的面积和之比应为0.48～0.55。

>>有关物质——按自身对照法测定有关物质限量

2、△2-异构体是取头孢呋辛酯对照品经加热破坏处理而制得的，其相对tR约为1.2 。

(三)、吸收度

1、如青霉素钠（钾）的吸收度检查：

>>取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.80～0.88。

>>此法中264nm 处吸收值用来控制青霉素钠（钾）的含量，280nm处吸收值用来控制杂质的量。

2、头孢氨苄中有关物质的检查——反相TLC法

四、含量测定

(一)、高效液相色谱法

1、这是β-内酰胺类抗生素含量测定的主要方法。中国药典收载的本类抗生素原料及制剂共约70种，应用HPLC法测定含量的有50多种，约占78%。

2、本类药物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外标法计算含量。

(二)、碘量法

1、利用青霉素或头孢菌素分子不消耗碘，而其降解产物消耗碘，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。反应分两步：

第一步：青霉素在碱性条件下水解，该步反应是按化学计量进行的。

第二步：水解生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定。

同时做空白试验。

并用青霉素标准品进行平行对照测定

第一步

第二步

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2、讨论：

>>温度(24-26℃ )。

>>pH（4.5)。

>>时间(15～ 20min)等影响反应，耗碘量没有固定的当量关系。