分子印迹渍介绍与分子杂交技术分析
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NL不具备)
－－结合能力较NC膜低
－－活化过程较复杂 4) 滤纸
结合能力较弱，但经济（基因文库粗筛的菌落原位杂交）
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
转膜
是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。
（1）物理吸印方法
（毛细虹吸 真空抽吸）
－－杂交本底较高分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
3) 化学活化膜（chemical activatedБайду номын сангаасmembrane）
将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜 （如ABM和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处 理而活化，产生活化基团（重氮盐）与DNA或RNA分子 共价结合。
• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
Eastern Blot
（1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦 后的 蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern 印迹。）
Dot Blot In situ hybridization
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相核酸印迹杂交类型
Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ
Northern Blot－－RNA （Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为 Northern印迹。）
Western Blot－－Protein（immunoblotting) （1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装
置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为 Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低 电压完成转移。）
hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
斑点杂交（Dot blot） 斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时 短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点 样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如 Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它们有许多孔， 样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反 复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的 膜就可以进行杂交。
在其表面的探针分子洗脱掉。 5) 具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
几种常用固相支持物
1)硝酸纤维素虑膜（nitrocellulose filter membrane）
• 具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达
80µ g/ cm2 ～ 100µ g/ cm2 ）。
（2）电转印方法
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
印迹（渍）技术
Southern Blot－－DNA（由Edwin Mellor Southern 等人首次应用） （1975年，Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜
（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。）
•真空烘干后，依靠疏水性相互作用。 •杂交本底较低。
－－不易反复杂交和洗膜（结合力） －－质地较脆，烘烤后更甚，小心操作 －－与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，
不易核酸电转
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
分子印迹渍介绍和 分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相支持物应具备的特点：
1) 具有较强的结合核酸分子的能力（>10µ g/ cm2 ） 2) 与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。 3) 与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作
过程。 4) 非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相核酸分子杂交类型
Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
（1）DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每
个样品一般点50μl（2～10μg DNA）。 ④将膜烘干，密封保存备用。
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。
• 韧性较强，操作方便。 • 能结合小分子核酸。 • 低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。 • 可反复杂交和洗膜。
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
RNA斑点杂交： 1）与上法类似，每个样品至多加10μg总 RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。 2）将RNA溶于5μl DEPC水，加15μl甲醛 /SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛） 使RNA变性。 3）然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘 干。
－－结合能力较NC膜低
－－活化过程较复杂 4) 滤纸
结合能力较弱，但经济（基因文库粗筛的菌落原位杂交）
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
转膜
是指将核酸,蛋白质等生物大分 子固定在纤维膜上的过程。将核酸或 蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上 或直接将核酸点到膜上。
（1）物理吸印方法
（毛细虹吸 真空抽吸）
－－杂交本底较高分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
3) 化学活化膜（chemical activatedБайду номын сангаасmembrane）
将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜 （如ABM和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处 理而活化，产生活化基团（重氮盐）与DNA或RNA分子 共价结合。
• DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。 •对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
Eastern Blot
（1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦 后的 蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern 印迹。）
Dot Blot In situ hybridization
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相核酸印迹杂交类型
Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ
Northern Blot－－RNA （Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为 Northern印迹。）
Western Blot－－Protein（immunoblotting) （1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装
置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为 Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低 电压完成转移。）
hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）可以确定探针的互补序 列在胞内的空间位置
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
hybridization） 组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
斑点杂交（Dot blot） 斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时 短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点 样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如 Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它们有许多孔， 样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反 复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的 膜就可以进行杂交。
在其表面的探针分子洗脱掉。 5) 具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
几种常用固相支持物
1)硝酸纤维素虑膜（nitrocellulose filter membrane）
• 具有较强吸附单链DNA和RNA的能力（高盐下达
80µ g/ cm2 ～ 100µ g/ cm2 ）。
（2）电转印方法
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
印迹（渍）技术
Southern Blot－－DNA（由Edwin Mellor Southern 等人首次应用） （1975年，Southren创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜
（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southren印迹法。）
•真空烘干后，依靠疏水性相互作用。 •杂交本底较低。
－－不易反复杂交和洗膜（结合力） －－质地较脆，烘烤后更甚，小心操作 －－与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，
不易核酸电转
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
2) 尼龙膜（nylon membrane）
• 结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达 350µ g/
分子印迹渍介绍和 分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相支持物应具备的特点：
1) 具有较强的结合核酸分子的能力（>10µ g/ cm2 ） 2) 与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反应。 3) 与核酸稳定牢固结合，能经受杂交、洗膜等操作
过程。 4) 非特异性吸附少，洗膜条件下能将非特异性吸附
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
固相核酸分子杂交类型
Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（Dot blot） 菌落原位杂交（Colony in situ
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
（1）DNA斑点杂交 ①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。 ②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。 ③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每
个样品一般点50μl（2～10μg DNA）。 ④将膜烘干，密封保存备用。
cm2 ～ 500µ g/ cm2 ）。
•真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
•微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。
• 韧性较强，操作方便。 • 能结合小分子核酸。 • 低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。 • 可反复杂交和洗膜。
分子印迹渍介绍和分子杂交技术分析
RNA斑点杂交： 1）与上法类似，每个样品至多加10μg总 RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。 2）将RNA溶于5μl DEPC水，加15μl甲醛 /SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛） 使RNA变性。 3）然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘 干。