生物技术大实验-自制2014年

• •
• •
注意事项
• 由于PCR技术非常敏感，可使一个 DNA分子得以扩增，装有PCR试剂的 微量离心管打开之前，应先在微量离心 机上作瞬时离心使液体沉积于管底。 最好在加完所有其它反应成分后才加模 板DNA，加模板DNA时不要形成喷雾。 若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反 应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体 系以防止反应过程中液体的蒸发。
pVAX1酶切位点的分布示意图
【实验仪器与试剂】 一、实验仪器 • 1、微量移液器 • 2、离心机 • 3、恒温水浴箱 二、试剂 • 1、EcoR I 和 Hind Ⅲ • 2、ddH2O
【实验步骤】 • 在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 质粒DNA 10×M Buffer Hind Ⅲ EcoR-I 体积（µ l） 10 2 0.5 0.5
器 材
• 1、水平板型电泳槽
• 2、直流稳压电泳仪
• 3、微量移液枪
• 4 、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行
凝胶图像的实时观测
三、操作方法
• 1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g 琼脂糖，臵于三角烧瓶中， 加入100mL TBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸， 琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。
实验原理
• 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在 拓扑学上的差异来分离它们。 • 在碱性pH，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开； 质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条链不会完全分离。 • 当用pH4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性 时，质粒DNA分子能够迅速准确地复性，呈溶解状态， 离心时留在上清中；而线状染色体DNA则不能复性，形 成缠绕的网状物，通过离心，染色体DNA与不稳定的大 分子RNA、蛋白质-SDS复合物一起沉淀下来而被除去。 • 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用无水乙醇沉淀 质粒DNA。
水
总计
7
20
• • •
2、将反应物臵于37℃水浴，温浴2小时。 3、加入5 µ l加样缓冲液，混匀后即可加样 进行电泳。 4、在紫外观察分析仪上观察酶切的结果。
1、琼脂糖凝胶电泳
一、实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。
•
•
• 【思考题】
• 1、PCR反应的原理是什么？ • 2、PCR反应体系包括那些？
实验二
质粒DNA的提取
质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多 个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的 筛选和鉴定； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
•
实 验 原 理
实验目的
本实验以食蟹猴人芽囊虫虫DNA 为模板，设计引物，扩增出1100 bp的 扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基 本原理与实验技术。
器材和试剂
器材 PCR扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机， 加样枪及枪头等
器材与试剂
试剂： 1、蓝色帽管：天根2×Taq MasterMix(内含Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg＋＋和上样buffer等） 2、白色管：引物 1 引物 2 3、白色管：无菌ddH2O 4、模板DNA：人芽囊虫基因组DNA
操作
• • • • • 无菌ddH2O 8 ul 2×Taq MasterMix 10 ul 引物1 0.5 ul 引物2 0.5 ul 模板DNA 1ul 总体积 20 ul 混匀后，高速瞬时离心 ，臵PCR仪上
操作
PCR扩增的设定： 设臵PCR扩增仪的热盖温度为99℃ 预变性：94 ℃4min 循环： 95℃变性45s 54℃退火 45s 35个循环 72℃延伸1min 最后延伸：72℃ 5min 产物进行电泳拍照。
[质粒提取试剂盒组成] 平衡液BL (Buffer BL) 溶液P1 (Buffer P1) 溶液P2 (Buffer P2) 溶液P3 (Buffer P3) 去蛋白液PD (Buffer PD) 漂洗液PW (Buffer PW) 洗脱缓冲液EB (Buffer EB) RNase A (10 mg/ml) 吸附柱CP3 (Spin Columns CP3) 收集管(2 ml) (Collection Tubes 2 ml)
稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）。
(注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质 粒中混有基因组片断。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底， 应减少菌体量。)
↓ 6.中和： 加350ul溶液P3 ，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出
现白色絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉
液内不存有气泡
待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润
湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板 上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳 槽平台上。倒入PBS缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。
称取Tris 242g，EDTA-Na2 37.2 g 溶于800 ml去离子水，充 分搅拌溶解，加入57.1 ml的乙酸，充分混匀定容至1000mL。
• 2、琼脂糖： 1g 溶于TAE缓冲液中加热配成100mL。
• 3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×Loading Buffer ） ： 取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。
1. 重量相等
离心管或试管需 平衡（称重） 2. 位臵对称
平衡好的离心管 或试管需对称 放臵
实验三 质粒DNA的限制性酶切 与鉴定
【实验目的】 学习通过限制性酶切法签定阳性克隆的方 法原理与技术，熟悉琼脂糖电泳原理及操 作。
1、质粒DNA的限制酶切
【实验原理】
• 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工 具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识 别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点 上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为 II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸 的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有 些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘 性末端的DNA。
注 意 要完全融化混匀
• 2、凝胶板的制备
臵水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插
进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水 平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左 右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平 板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静臵0.5 注 小时。 意
澄清。
实验仪器与材料
（一）仪器：超净工作台， 恒温摇床，台式离心机，
高压灭菌锅
（二）材料：1.5ml 离心管，
加样枪，含有质粒pVAX1
的大肠杆菌TOP10 、LB液
体培养基
实验步骤
1. 细菌培养：接种含质粒pVAX1的大肠杆菌TOP10 10μl 到10ml含氨苄青霉 素(100μg /ml)的LB培养液中， 37℃摇培过夜（10~12h）
实验一、PCR技术及应用
实验原理
• 多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。可简述为： • 在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微 量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP）， 和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物， 并有Mg2+存在。
实验原理
• • • 加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这 是所谓变性阶段。 降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA 互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以 四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条 双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。 如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复 性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在 重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模 板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式 扩增。经过25～35个循环，DNA扩增倍数可达106～109。
[实验准备]
1. 使用本试剂盒之前，先在溶液P1中加入RNaseA。溶液 P1使用完毕后，请立即至于4℃保存。 2. 漂洗液PW在第一次使用前需加入无水乙醇，15ml的漂
洗液中需加入60ml的无水乙醇，混匀后方可使用。
3. 使用前先检查平衡液BL、溶液P2 和P3 是否出现浑浊，
如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复
• 4、0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离 子水溶解，定容至 100mL。从中取 1mL，用无离子水稀释 至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）
• 5、DNA Marker （TaKaRa公司）
1）DL2,000TM DNA Marker
本 Marker为已含有1×Loading Buffer的DNA溶液 可取5μL直接电泳
2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 12000 rpm，1min
倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上
3. 收集菌体： 取1.5ml菌液转入小离心管中
↓ 12000 rpm，1min
弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。
4.悬浮： 加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底 悬浮细菌沉淀。（注：一定要彻底悬浮，否则抽提质粒DNA的纯度及得率会 大大降低）。 ↓ 5. 裂解：加250ul溶液P2，立即轻柔颠倒离心管6-8次, （此时菌液应变得清亮粘


DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应 与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同 的区带。
二、试剂与器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子 电泳槽
取液器
溴酚蓝
试 剂
• 1、50×Tris- 乙酸 -EDTA 缓冲液（ TAE 缓冲液）， pH8.3 ：
质粒的复制型
质粒在细胞内的复制一般有两种类型: – 严谨型(Stringent control) ：只在细胞 周期的一定阶段进行复制，当细胞染 色体复制一次时，质粒也复制一次， 每个细胞内只有1～2个质粒 – 松弛型(Relaxed control) ：质粒在整 个细胞周期中随时可以复制，当染色 体复制停止后，质粒仍然能继续复制， 每个细胞中含有10-200个拷贝。
DNA的保存
1、短期贮存：
4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）缓冲液中。 TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反 应，PH低于7.0时DNA容易变性。 2、长期贮存： 臵于TE缓冲液中-70℃可保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿 可有效防止细菌和核酸的污染。
离心的注意事项
实验目的
• 掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及 各主要试剂的作用。
质粒提取的主要步骤：
•细菌的培养 •细菌的收集和裂解
•质粒 DNBiblioteka Baidu 的分离和纯化
提纯的思路
• 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量 DNA • 要去除的物质： 蛋白 基因组DNA RNA
碱裂解法抽提质粒
1.质粒提取试剂盒(离心柱型)
淀）。
↓12000 rpm, 10 min
7.转移上清：将上清转移到CP3中（注意尽量不要吸出沉淀） ↓12000 rpm, 30-60sec 8. 漂洗DNA：向吸附柱CP3中加入600 μl漂洗液PW（请先检查 是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30-60 sec，倒掉收集管 中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。 9 . 重复步骤8。 10. 去漂洗液：将空吸附柱重新置于收集管上，10000rpm， 2min，以除去吸附柱中残余的漂洗液。 11. 收集质粒：将吸附柱置于一个干净的小离心管上，向吸附膜 的中间部位滴加30-50ul洗脱漂洗液EB（或dw），放置2min， 12000 rpm，2min，离心管中即为收集的质粒溶液，做好标记， 低温保存备用。