第六章 目的重组子的筛选与鉴定 PPT

+ampicillin
+ ampicillin + tetracycline
these colonies have bacteria with recombinant plasmid
2．互补筛选Fra Baidu bibliotek
利用-半乳糖苷酶基因构建的载体如pUC系列的质粒 常采用互补筛选。-半乳糖苷酶 (-galactosidase) 是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶，最常用 的-半乳糖酶基因来自大肠杆菌的Lac操纵子，它们 使载体中带有大肠杆菌Lac操纵子的调节序列和编码 -半乳糖苷酶N末端146个氨基酶的序列。用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导这个氨基末端片段 的合成，合成的片段能与宿主编码的-半乳糖苷酶缺 陷型进行基因内互补，恢复该酶的活性，这一过程 称-互补。
但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未 酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成 的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是 阳性重组子的初步筛选。
同样还可应用插入失活双抗生素对照筛选法，在含 有两个抗药性基因的载体中，通过插入失活其中一 个基因，可用两个分别含有同药物的平板对照筛选 阳性重组子。如pBR322质粒含有Tetr、Ampr双抗 药性，插入失活Tetr后，Tet r 、Ampr为含载体的阴 性菌落，Tet - 、Ampr表型的菌落为阳性，Tet - 、 Amp - 的表型不能生长，对未转化的受体细胞，该 方法筛选出阳性重组子的几率较高(Tetr：四环素抗 性；Ampr：氨苄毒霉素抗性，Tet - ：对四环素敏感； Amp - ：对氨苄青霉素敏感)
二、应用限制性内切酶酶切分析筛选
对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培 养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用 相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入 片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切 酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片 段和载体的大小。
所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外 源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基 因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区 分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。 但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工 作量极大，实验成本也高。
因此当载体带有LacZ调节序列和编码半乳糖苷酸 N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列 缺陷、其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编 码的片段本身都没有活性，但它们互相协助则可在 大肠杆菌内形成一个具有酶活性的蛋白质。故在诱 导物IPTG存在下，细菌在含生色底物5-溴-4-氯-3吲哚--D-半乳糖苷(X-gal)培养基的平板上可形成 蓝色菌落。当在质粒多克隆位点中插入外源DNA时， 可使-半乳糖苷酶的氨基末端失活，从而不能进行 互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。
第六章 阳性重组子的筛选和鉴定（检）
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必 须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化 子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重 组子。
• 转化子
• 重组子
• 目的重组子
阳性重组子的筛选和鉴定（检）
一、根据遗传表型筛选 二、应用限制性内切酶酶切分析筛选 三、核酸探针筛选 四、PCR筛选 五、菌落原位杂交技术
4．噬菌斑筛选
对于以λ噬菌体载体系统，外源DNA插入λ噬菌 体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型 λDNA长度的78％～105％范围内，才能在体外 包装成具有感染活力的噬菌体颗粒，感染细菌后， 形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA片段插入的载 体不能包装成噬菌体颗粒，不能感染细胞并形成
噬菌斑，从而达到初步筛选的作用。
三、核酸探针筛选
为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切 酶消化重组子凝胶电泳分离后，通过Southern印 迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核 素或非放射性标记的相应外源DNA片段作为探针， 进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所 需的靶基因片段。
四、PCR筛选
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
Screening by insertional inactivation of a resistance gene
Ampr Tcr
pBR322
BX B
ori Ampr
B Ampr
X
Tcr
ori
B
Ampicillin resistant? yes
Tetracycline resistant? No
ori
yes yes
Replica plating: transfer of the colonies from one plate
to another using absorbent pad or Velvet (绒布).
transfer of colonies
蓝白筛选
3．插入表达筛选
有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负 调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的 筛选标志基因才能表达，如pTR262质粒其Tetr基因 上 游 存 在 CI 基 因 的 负 调 控 序 列 ， CI 基 因 可 以 抑 制 Tetr 基 因 的 表 达 ， 当 外 源 DNA 片 段 插 入 CI 基 因 的 HindⅢ或Bgl I位点时，Tetr基因阻碍解除而表达， 阳性重组子为Tetr表型，而质粒本身为Tet - 表型， 故转化细菌在Tetr平板中，只有含外源DNA插入片 段的阳性重阻子的转化菌才能生长成菌落。
不同检测方法可以归类于以下三个层次： 1. 载体遗传标记检测 2. 克隆DNA序列检测 3. 外源基因表达产物检测
一、根据遗传表型筛选
1．抗生素平板筛选 2．互补筛选 3．插入表达筛选 4．噬菌斑筛选
1．抗生素平板筛选
大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有 抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗 卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载 体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的 插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子 的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长 成菌落。