发酵豆粕的检测方法

m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数； 6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
三、发酵豆粕中总酸的测定——NaOH 滴定法
1 原理 根据酸碱中和反应的实质: H++OH-= H2O，即 K·C 标·V 标= C 待·V 待。已知碱
的体积,并知道 NaOH 标准溶液的物质的量浓度,可以计算出发酵豆粕中总酸的含 量（由乳酸折算成总酸）。
4.2 水溶性蛋白的测定 4.2.1 操作步骤
称取发酵豆粕 m 3～5g（准确至 0.0001 g）于 250mL 具塞三角瓶内，准确加 入 100.00mL 蒸馏水。摇匀后，室温振荡 30min，静置 5min，将上清液倒入 50mL 离心管内,4800r/min，离心 15min。
取上清液 10.00mL 于消化管内，加入 2g～3g 混合催化剂，12mL 浓硫酸， 将 蒸馏管置于通风橱中加热消化。开始用 100℃低温加热 0.5h，至黑泡沫消失， 控制瓶中泡沫不超过瓶管的 2/3，然后再升温至 400℃～430℃，加热 1.5h，至 消化液呈透明的蓝紫色时，继续加热 0.5h。
标定：精密称取经 270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约 0.15g，加水 50mL 溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂 10 滴，用本液滴定到溶液由绿色变 为紫红色。煮沸 2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时 做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算：
C=
m
………………………………………………(1)
称取粉碎试样 3-5g（精确至 0.01g）于 250mL 三角瓶中。吸取 100mL 20℃ 蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温 度控制在(20 士 2)℃.，振荡 60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过 滤。过滤完毕后，取 10mL 上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或
小肽含量（﹪）= CP 三氯乙酸(%)—游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017；
CP 三氯乙酸(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100% 二式中： V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中： V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。 4.2 小肽含量的测定 4.2.1 操作步骤 称取发酵豆粕 m 3～5g（准确至 0.0001 g）于 250mL 具塞三角瓶内，准确加 入 100.00mL 150g/L 的三氯乙酸溶液。摇匀后，室温振荡 30min，静置 5min，将 上清液倒入 50mL 离心管内,4800r/min，离心 15min。 取上清液 10.00mL 于消化管内，加入 2g～3g 混合催化剂，12mL 浓硫酸，420℃ 消化 1.5h。冷却后，缓慢向消化管内加入约 10mL 蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。 2%的硼酸溶液吸收，0.1mol/L 的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积 V。 4.2.2. 计算：
半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
游离氨含量（﹪）={[(V-V0)×C×0.017×100]/(m×10)}×100% 式中： V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，单位为毫升(mL)； C ——盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m ——试样的质量，单位为克（g）； 0.017——铵根离子的毫克当量数。
标定：精密称取经 270℃～300℃干燥恒重过的基准碳酸钠约 0.15g，加水 50mL 溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂 10 滴，用本液滴定到溶液由绿色变 为紫红色。煮沸 2min，冷却至室温， 继续滴定到溶液由绿色变为暗紫色，同时 做空白试验。
盐酸标准溶液的浓度按式（1）计算：
C=
m
………………………………………………(1)
发酵豆粕中水溶性蛋白含量的测定
1 方法原理
用水提取大豆中的水溶性蛋白，硫酸使含氮物转化成为硫酸铵，加强碱蒸馏 使氨逸出，用硼酸吸收后，用标准盐酸滴定计算含氮量，乘以换算系数计算出大 豆中水溶性蛋白的含量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相 当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。 2.3 20g/L 硼酸溶液：称取 100g 硼酸（H3BO4）溶于 5000mL 水中。 2.4 400g/L 氢氧化钠溶液：称取 2000g 氢氧化钠（NaOH）溶于 5000mL 水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取 8.3mL 盐酸，溶于 1000mL 水中。
2 试剂和材料
2.1 NaOH 标准溶液[C(NaOH)=0.1mol/L]：称取 4.000g NaOH 溶于 1000mL 新沸 过的冷水中。 标定：取在 105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约 0.6g,精密称定，加 新沸过的冷水 50mL，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液 2 滴，用本液滴 定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。 每 1mL 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于 20.42mg 的邻苯二甲酸氢钾。
冷却后，缓慢向消化管内加入约 10mL 蒸馏水，摇匀，冷却后蒸馏。2%的硼酸 溶液吸收，0.1mol/L 的盐酸溶液滴定，消耗盐酸体积 V。 4.2.2 计算：
CP 水(%)={[（V-V0）×CHCL×0.014×6.25×100]/(m×10)} ×100%
—游离氨含量（﹪）×0.014×6.25∕0.017
(V1−V 2)× 0.0530
式中： m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）；
V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3 的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
1.0g/L 甲基红乙醇溶液：称取 0.1g 甲基红溶于 100mL 乙醇中；5.0g/L 溴 甲酚绿乙醇溶液：称取 0.5g 溴甲酚绿溶于 100mL 乙醇中；两溶液等体积混合， 在阴凉处保存期为 3 个月。 2.7 混合催化剂[ （CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取 10g 硫酸铜（CuSO4·5H2O） 和 100g 硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm 筛。 2.8 硫酸铵。 2.9 150g/L 三氯乙酸溶液：取 150g 三氯乙酸溶于 1000mL 水中。 3、仪器设备 3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径 0.45mm(40 目)。 3.3 分析天平: 感量 0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25 或 10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。 3.8 凯氏烧瓶: 100 或 500mL。 3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。 3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
(V1−Vຫໍສະໝຸດ Baidu2)× 0.0530
式中： m—无水碳酸钠的质量，单位为克（g）； V1—盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； V2—空白试验盐酸溶液用量，单位为毫升（mL）； 0.0530—Na2CO3 的毫克当量。 2.6 混合指示剂。
1.0g/L 甲基红乙醇溶液：称取 0.1g 甲基红溶于 100mL 乙醇中；5.0g/L 溴 甲酚绿乙醇溶液：称取 0.5g 溴甲酚绿溶于 100mL 乙醇中；两溶液等体积混合， 在阴凉处保存期为 3 个月。 2.7 混合催化剂[ （CuSO4+K2SO4）=10+100]:称取 10g 硫酸铜（CuSO4·5H2O） 和 100g 硫酸钾（K2SO4）,混匀，研磨，过 0.42mm 筛。 2.8 硫酸铵。 3、仪器设备 3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛: 孔径 0.45mm(40 目)。 3.3 分析天平: 感量 0.0001g。 3.4 滴定管: 酸式, 25 或 10mL。 3.5 具塞三角瓶: 250mL。 3.6 恒温振荡器。 3.7 消煮炉或电炉。 3.8 凯氏烧瓶: 100 或 500mL。 3.9 凯氏蒸馏装置: 常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式。 3.10 三角瓶: 250mL。 3.11 容量瓶: 100mL。 3.12 消煮管：250 mL。 3.13 定氮仪：以凯氏原理制造的各类型半自动，全自动蛋白质测定仪。 3.14 离心机。 3.15 中速定性滤纸。 4 操作步骤与计算 4.1 游离氨含量的测定 4.1.1 操作步骤
3.7 碱式滴定管：10 或 20mL。 3.8 pH 计：分度值 0.05。 3.9 粉碎机。
4 测定步骤
称取样品 10g（准确至 0.001g），加到 250mL 烧杯中，加蒸馏水 100mL（因 搅拌时一些粉末会贴壁，需用玻璃棒，可先加 90mL，再用 10mL 冲洗玻璃棒）， 在磁力搅拌器上搅拌 30min 后，过滤于锥形瓶中（或转入 50mL 离心管中，4000rpm 离心 5min），准确移取滤液 10.00mL，加入 40.00mL 新沸过的冷水后，用 0.02M 的 标准 NaOH 溶液滴定，酚酞为指示剂（2-3 滴），至溶液变为粉红色为滴定终点（若 样品颜色太深，难以观察终点，以 pH=8.15 为滴定终点）。记录消耗的 NaOH 的体 积，记为 V (mL)。 同时做空白对照。
称取粉碎试样 3-5g（精确至 0.01g）于 250mL 三角瓶中。吸取 100mL 20℃ 蒸馏水于三角瓶中，振摇使试样不结块，均匀分散。 将三角瓶固定于摇床，温 度控制在(20 士 2)℃.，振荡 60 min。 取下三角瓶，将溶液用中速定性滤纸过 滤。过滤完毕后，取 10mL 上清液，上机蒸馏、滴定；或采用常量直接蒸馏式或 半微量水蒸气蒸馏式凯氏蒸馏装置蒸馏、滴定。 4.1.2 计算
化蒸馏滴定，测定三氯乙酸（水）沉淀蛋白的量，减去游离氨的量既得小肽的量。 2、试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认的分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相 当纯度的水。 2.1 硫酸（H2SO4）。 2.2 盐酸(HCl)。 2.3 20g/L 硼酸溶液：称取 100g 硼酸（H3BO4）溶于 5000mL 水中。 2.4 400g/L 氢氧化钠溶液：称取 2000g 氢氧化钠（NaOH）溶于 5000mL 水中。 2.5 盐酸标准溶液[c(HCl)=0.1mol/L]：量取 8.3mL 盐酸，溶于 1000mL 水中。
式中：
V——滴定样品消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； V0——滴定空白消化液所耗盐酸标准溶液的体积，mL； C ——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
m ——试样的质量，g； 0.014━氮的毫克当量数； 6.25 ━氮换算成蛋白质的平均系数。
二、发酵豆粕中小肽含量的测定——三氯乙酸沉淀法
1、方法原理 试样用三氯乙酸（水）溶解后，使蛋白质和大分子肽沉淀，过滤，上清液消
2.2 NaOH 标准溶液[C(NaOH)=0.02mol/L]：0.1 mol/L NaOH 标准溶液加新沸过 的冷水稀释制成。必要时，可用盐酸滴定液（0.02mol/L）标定浓度。
2.3 酚酞指示液：取酚酞 1g，加乙醇 100mL 使溶解，即得。
3.仪器、设备
3.1 分析天平，感量 0.001g。 3.2 容量瓶：100、1000mL。 3.3 烧杯：100 mL。 3.4 磁力搅拌器。 3.5 高速离心机。 3.6 离心管：50mL。