第八章分子杂交技术

2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双
链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成 中心序列
（4）形成完整的双链分子
二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交 去除未参与杂交的探针
加入标记核酸探针
检测杂交信号
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动， 直到溴酚蓝从蓝变黄。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图 谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析 、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等 。
步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然 后使DNA原位变性。
按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
一、Southern杂交
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相 载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
(1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针
合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
第八章
分子杂交技术
第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下
按碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（ 主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序 完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此 之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同 源性）就可以形成杂交双链
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
再 把凝胶浸在灭菌双蒸水中
如果靶序列<5kb，则直接进行下面的步骤
杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 提纯的
细胞总DNA 细胞总RNA
细胞内杂交（细胞原位杂交）
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使 用的探针已知序列进行特异性的靶序列 检测。
凝胶
滤膜
转膜
wenku.baidu.com吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子 量DNA也能显影出条带。
（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间
的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链
核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双 链核酸分子链 间的氢键断裂。
（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛 等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交 →洗涤→放射自显影或显色反应。
三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。 制备方法：
8个以上碱基序列相同，最好不用。
3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的 信号。
标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
第二节 核酸分子杂交的方法
按其分子种类划分 （1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
（二）复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双
链核酸的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补 形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。