扫描电镜及其制样技术

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一、扫描电镜的基本结构 与成像原理
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1、 SEM基本结构及其作用
（１）电子光学系统
电子枪：阴极、阳极、栅极。
阴极—通电加热后产生电子束。 阳极—加速电子束。 栅极—控制和会聚电子束流 。
电磁透镜：会聚电子束，形
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（二）扫描电镜的特点
观察表面形貌。
图象景深大，富有立体感。
放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数
10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直 径，一般为5~10 nm。
可观察块状样品： 0.5~10cm3。
样品制备简单。
可结合元素分析。
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三、扫描电镜生物样品制备技术
素，在图象上也会形成一定的亮度差异， 这种现象称为原子序数效应。 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀 一层原子序数高的金属膜，可提高图象质 量。
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2、影响图象形成的因素
（3）充放电效应
充电：当初级电子轰击干燥的生物 样品表面时，会因其导电性能差而 发生电荷积累的充电现象，并对随
后到来的初级电子产生排斥，使电 子散开，且导致二次电子发射轨迹 偏斜或杂乱。
放电：轰击区内电子堆积，与邻近
区域间产生电位差，则可产生放电 打火现象。
充放电效应：上述充、放电状况造
成图象忽明忽暗或模糊不清等现象， 称为充放电效应。
对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴
样品等导电处理，可减少充放电效
应的20影21/3响/27。
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（２）检测系统
② 二次电子检测系统 的组成及作用
组成：检测器（二次 电子探头）、光电倍 增管、视频放大器。
作用：对二次电子进 行收集、放大和处理， 以调制显像管栅极电 压并成象。
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CHENLI 图1-1 扫描电镜工作原理图7
（３）电子偏转系统（扫描系统）
（1）固定的目的
保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状
态。
使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表
面张力变化的能力。
提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。
（2）常用的固定剂
戊二醛：常用浓度为1~4%。
锇酸：一般用1~2%浓度。
（3）固定的方法
先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清
∴ 样品的倾斜角效应是影响图 象反差的主要因素。
∴ SEM图象的反差主要是由样 品表面的凹凸状态决定的，越 是凸出的部位产生二次电子的 数量越多，图象越明亮，反之 则较暗。
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图1-2
样品倾斜对二次电子产率的影响
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2、影响图象形成的因素
（2）原子序数效应 原子序数效应：样品内原子序数不同的元
（3）清洗的方法 浸泡清洗。
震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。
离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。
（4）清洗的要求
样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净， 以充分暴露表面特征。
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3、固定
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图1-4
血细胞充放电效应图例 11
二、扫描电镜的特点
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（一） 图 谱
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扫描电镜技术
Techniques of Scanning Elecwk.baidu.comron Microscope
一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术
（一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法
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扫描电镜技术
扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种 电镜，用于观察物质表面及断面的三维形 貌结构和进行微区成分分析。
组成：扫描发生器、 扫描线圈。
作用：使镜筒和显 像管内的电子束分 别进行同步光栅状 扫描，最后在显像 管的荧光屏上显示 出完整图象。
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图1-1 扫描电镜工作原理8 图
2、影响图象形成的因素
（1）倾斜角效应 —— 二次电子成像原理
∵ 二次电子产率主要取决于电 子束的入射角，而入射角又主 要取决于样品的倾斜程度。
成直径5~10纳米的电子束（即电 子探针），照射于样品上 。
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图1-1 扫描电镜工作原理5 图
（２）检测系统
①二次电子的来源及作用 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区
域，被入射电子（初级电子、一次电子） 所激发出来的样品原子中的外层电子， 称谓二次电子（次级电子）。 SEM通常是由二次电子所形成的图象来 显示生物样品的表面形貌。
样品的基底部应切割平整（以便于样品 粘贴），观察面应作好识别标记。
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2、清洗
（1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆
盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织 等）的初级清洗。
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（一）样品的常规制备方法
取材 → 清洗 → 固定 → 清洗 →脱水 →干燥 → 金属镀膜 → SEM观察
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1、取样
取样部位要准确。 取样大小要适当：常为≤1cm3。 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对
样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。
洗后，再用锇酸固定30~60分钟。
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4、脱水
（1）脱水的目的
用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙 醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使 样品在后续干燥处理时的表面张力减少。
表1 几种液体的表面张力 单位：达因/cm
液体
乙醇
丙酮
水
表面张力 16.49（20℃） 2 1.16（40℃） 70.61 (20℃）