第五章 脱毒苗的培育

第五章脱毒苗的培育
目前病毒病已成为世界作物生产中仅次于真菌病害的主要病害，是造成大田作物和园艺作物的生活力、产量和品质下降，甚至造成植株大面积死亡的重要原因之一，给农业生产造成巨大的危害和损失。

由于病毒复制与植物代谢密切相关，而且有些病毒的抗逆性很强，至今仍没有一种特效药物能够实现既能有效防治病毒病害，又不伤害植物。

因此，通过组织培养来培育脱毒苗，无疑满足了农作物和园艺植物生产发展的迫切需要。

所谓“脱毒苗”，又称“无病毒苗”，是指不含有该种植物的主要危害病毒，即经过检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。

因此，准确地说，“脱毒苗”是“特定无病毒”，应称为“检定苗”。

通过组织培养技术培育的脱毒苗具有以下特点：①提高产量。

如草莓脱毒可提高产量20%～30%，单株结果多，单果重增加；马铃薯脱毒可提高产量40%以上；观赏花卉平均增产50%～80%。

②提高品质。

如苹果着色好，糖度高；菊花切花生长健壮，植株增高，优质切花数增多，花朵增大，花色艳丽，商品价值高。

③抗病性增强。

植物脱毒后自身抗逆性提高，对病虫的抗性增强，如甘薯脱毒后可增强抗茎线虫病。

目前，通过组织培养手段培育脱毒苗已成为农作物、园艺植物、经济作物优良品种繁育、生产中的重要环节。

世界不少国家十分重视这项工作，把脱除病毒纳入常规良种繁殖的一个重要程序，建立了大规模的无病毒生产基地，为生产提供无病毒优良种苗，已在生产上发挥了重要作用，取得了显著的经济效益。

第一节脱毒方法
目前，组织培养应用的脱毒方法有热处理、微茎尖培养、茎尖培养结合热处理、茎尖微体嫁接、愈伤组织培养、花药培养等脱毒方法。

其中，前三种脱毒方法最常用，也最容易掌握。

实践证明，根据植物种类和待检病毒的种类、特性不同，采取不同脱毒方法的组合处理，其脱毒效果会更好。

本节重点介绍热处理脱毒法和茎尖培养脱毒法。

一、热处理脱毒
(一)热处理方法
1.温汤浸渍处理
将材料放在50℃～55℃的温水中浸渍10min至数小时，可使一些热敏感的病毒失活。

此法简便易行，适用于休眠器官、剪下的接穗或种植材料的脱毒处理，但易使材料受伤。

为避免长时间浸泡对植物材料的伤害，一般采用热空气处理脱毒。

2.热空气处理
热空气处理脱毒适用于鲜活植物材料的脱毒。

将生长的盆栽植株、种球、愈伤组织、离体瓶苗等移入温热治疗室或生长箱内，以35~40℃的温度处理几十分钟至数月。

至于具体的处理温度与处理时间可按照植物种类、器官类别和生理状况，以及待脱除病毒的种类等来综合确定。

如香石竹在38℃下处理2个月，其茎尖所含病毒即可被清除；马铃薯在35℃下处理几个月能够脱除卷叶病毒。

如果采用热处理再结合茎尖培养，其脱毒效果会更好。

如草莓茎尖培养结合36℃处理6周，比单纯的茎尖培养更能有效地清除轻型黄边病毒。

此外，每种植物都有热处理临界温度，过高温度处理会造成植物的伤害(图5-1)，所以采用变温处理既可消除病毒但又不伤及植物。

如马铃薯每天40℃下处理4h与16℃～20℃20h 交替变温处理马铃薯块茎，既清除了芽眼中的叶片病毒，又保持了芽的活力。

<![endif]>(二)热处理脱毒法的缺陷
1.热处理不能脱除所有病毒。

如在马铃薯中应用此技术，只能消除卷叶病毒。

一般而言，热处理主要对球状病毒、类似纹状病毒及植原体（也叫类菌原体或类菌质体，为原核生物）等起作用。

2.延长热处理时间，病毒钝化效果好，但也可能会钝化寄主植物的阻抗因子，致使寄主植物抗病毒因子难于活化，从而降低无毒植株的发生率。

3.热处理对植物组织有一定伤害，只有部分植株能够存活。

鉴于热处理脱毒存在上述缺陷，热处理最好与其他脱毒方法配合使用，脱毒效果好。

二、微茎尖培养脱毒
(一)微茎尖培养脱毒方法
微茎尖培养脱毒操作程序见图5-2。

其技术关键包括以下几方面：
1.病毒种类及分布的诊断
在实施脱毒操作之前，应根据欲植物所携带的病毒种类及其在体内的分布状况，确定切取茎尖的大小。

病毒分布少，切取的茎尖可稍大，否则宜小。

2.母体植株的选择及预处理
选择母体植株，首先要考虑是否具有原品种的典型特征特性，这关系到培养的脱毒苗是否失真；其次要考虑感染病毒的轻重和携带病毒的多少。

在感染病毒程度较轻、携带病毒较少的植株上采集外植体，利于培养出脱毒苗。

母体植株的预处理是为了获取表面不带病原菌的茎尖外植体。

可在切取茎尖前，将母体植株栽种在温室内无菌的盆钵中培养。

浇水时不要直接浇在叶片上，最好定期喷施内吸杀菌剂，如喷施0.1%多菌灵和农用链霉素等。

对于田间种植的母体植株，可以切取插条插入营养液中，在其腋芽抽生的枝条上选取外植体，这比从田间直接取材的污染率要小得多。

在剥取茎尖外植体前，需对茎芽进行表面灭菌。

叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花的芽，只须在75%酒精中浸蘸一下即可；叶片包被松散的芽，如香石竹、大蒜、马铃薯等的芽，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。

实际消毒时应灵活运用这些消毒方法。

3.微茎尖的剥离
在解剖镜下剥离微茎尖(图5-3)。

微茎尖剥离方法见技能5-1。

4.培养基
①微茎尖培养时，一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基。

②由于双子叶植物的生长素和细胞分裂素是由第2对最年幼的叶原基合成，所以培养不带叶原基的微茎尖时，需要在培养基中适当提高激素的浓度。

③为了使培养的脱毒苗能保持原品种的特征特性，应避免使用容易促进外植体愈伤组织化的植物激素。

如生长素类应使用NAA或IBA，而避免使用2,4-D，细胞分裂素类可用KT或BA；GA对某些植物微茎尖培养有利，应注意选择使用。

④为了有利于茎尖的生长，常需要提高培养基中钾盐和铵盐的含量；以MS 作为微茎尖培养的培养基时，应适当降低部分离子的浓度。

⑤为了操作方便和加快扩繁速度，一般都使用琼脂培养基，但当其能诱导外植体愈伤组织化时，最好改用液体培养基。

使用液体培养基时，需制作滤纸桥，将微茎尖接种于桥面上。

5.接种和培养
微茎尖剥离后，应尽快接种在培养基上。

接种时只用解剖针接种即可，确保微茎尖不能与芽的较老部分或解剖镜台或持芽的镊子接触，避免材料染菌。

接种后置于23℃～27℃左右、光照10～16h/d、光强1000~5000 lx的条件下培养。

微茎尖培养必须保证较高的温度和充足的光照时间，否则在低温和短光照条件下，茎尖容易进入休眠状态。

微茎尖初代培养需数月才能完成，其后续培养与茎段培养相同，在此不再赘述。

植株再生途径为无菌短枝发生型(图5-4)。

(四)影响微茎尖培养的因素
1.外植体大小
通常微茎尖培养的脱毒效果与微茎尖大小呈负相关，而培养茎尖的成活率则与茎尖大小呈正相关，即茎尖越小，对培养基的要求越高，培养成活率越低，脱毒效果越好；茎尖越大，则与之相反。

实践证明，茎尖剥离时不带叶原基，其脱毒效果最好，但成活率最低；而带1~2个叶原基的茎尖培养，一般可获得40%以上的脱毒苗。

通常切取带1~2个叶原基的茎尖进行培养，以达到既脱毒又保证成活率的目的。

2.母体植株受病毒侵染的程度
一般单一病毒侵染的植株脱毒较容易，多种病毒复合侵染的植株脱毒则较难。

3.培养基和培养条件
见前述内容。

4.其他
参考第四章第二节的内容。

三、其他脱毒方法
表5-1 其他脱毒方法简介
第二节脱毒苗的鉴定
经过脱毒处理得到的种苗，必须经过严格的鉴定，确证其无病毒且农艺性状优良之后，才可以作为脱毒良种种苗用于实际生产。

脱毒苗的鉴定包括两个方面：一是脱毒效果的鉴定；二是农艺性状的鉴定。

一、脱毒效果鉴定
对于非潜隐性病毒，可以通过直观检测法就能观察有无病毒病症状；对于潜隐性病毒病则必须通过病毒检测。

病毒检测方法有指示植物法、抗血清鉴定法、酶联免疫吸附测定法、电子显微镜法和分子生物学检测法等。

其中，指示植物法和抗血清检测法是目前国内外常用的病毒鉴定方法。

(一)指示植物法
1.指示植物和指示植物法的含义
指示植物法是指利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准，又称为枯斑法。

这些对病毒敏感并能产生专一性枯斑症状的植物称为指示植
物，又称为鉴别寄主。

指示植物一般分为二类：一类是接种病毒后产生系统性症状，病毒可扩展到植株非接种部位，通常没有局部病斑的指示植物；另一类是只产生局部病斑，常为坏死、褪绿或环状病斑的指示植物。

部分常用指示植物见表5-2。

表5-2 一些常用指示植物及其检测的病毒 (引自王清连，2004)
2.对指示植物的要求
①根据病毒种类的不同，选择适合的指示植物(因病毒的寄主范围是不同的)；②一年四季都能栽培和容易接种；③能够较长时期内保持对病毒的敏感性；
④在较广的范围内具有同样的反应。

3.鉴定方法
(1)汁液涂抹法取被鉴定植物的1~3g幼叶置于研钵中，加入10ml水和等量的0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0），研碎后加入少量500~600目金钢砂作为摩擦剂，制成匀浆，用手指(戴上手套)或纱布或棉球蘸取匀浆在指示植物叶片上轻轻涂抹2～3次，以汁液进入叶表皮细胞又不损伤叶片为度，或用喷枪喷射进行接种。

5min后用清水清洗叶面多余匀浆及金刚砂。

接种后将指示植株置于
室内或防虫网室内，在半遮荫、温度15~25℃的条件下培养，2~6d后可视其病症的有无，来判断被鉴定植物是否脱毒。

若汁液带病毒即出现可见病症(表5-3)。

表5-3 几种马铃薯病毒的指示植物及其症状(引自潘瑞炽等，2000)
液涂
抹法
主要
用于
草本
植物
的脱毒鉴定，适用于鉴定通过汁液传播的病毒。

利用指示植物法鉴定时，一般以早春为宜，因为早春刚萌发嫩叶或花瓣，接种成功率较高，5月份以后接种较难成功，从而影响检测结果的正确性。

(2)嫁接法将被鉴定植物的芽或幼叶嫁接在指示植物上，4~6周后根据指
示植物的症状来判断是否脱毒。

此法适用于非汁液传播病毒的鉴定。

如草莓的黄化病毒、丛枝病毒等。

一般木本植物和一些无性繁殖的草本植物的脱毒鉴定常用此法。

一般有以下三种嫁接方法：
①直接在指示植物上嫁接待检植物的芽片或小叶(见技能5-3)。

②双芽嫁接法。

在休眠期剪取指示植物和待检植物的接穗，萌芽前分别把带有两个芽的指示植物接穗与待检植物接穗同时切接在实生砧木上，指示植物接穗接在待检接穗上方(图5-5)。

③双重芽嫁接法。

先将指示植物的芽嫁接到实生砧木基部距地面10～20cm处，再在接芽下方嫁接待
检植物的芽，两芽相距2～3cm。

成活后剪去指示植物芽上部的砧干(图5-6)。

一般夏秋芽接，次年观察结果。

(二)抗血清鉴定法
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种较好的抗原，给动物注射后会引起抗体产生。

抗体是动物受外来抗原的刺激产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中。

有抗体存在的血清叫抗血清。

不同病毒引起的抗血清有各自的特异性。

病毒作为抗原与其相对应抗体的抗血清之间会发生沉淀反应，即免疫反应，因而抗血清可作为病毒检测的高度专化的试剂。

用被鉴定的组培苗的汁液作为抗原，加入已知病毒的抗血清中，观察其反应，可判知被鉴定植物有无病毒和病毒种类，此法称为抗血清鉴定法。

此法因具有高度的特异性而鉴定速度快，一般几小时甚至几分钟就可完成，所以是植物病毒鉴定的最有用的方法之一。

抗血清鉴定法包括抗原制备、抗血清收集、免疫反应试验等，具体操作程序见图5-7。

利用
抗血清鉴定时要注意避免叶绿体的自发凝聚，可用磷酸缓冲液提取汁液，再用氯
仿处理除去叶绿体，保持pH在6.5~8.5之间。

另外，抗原和抗体的比例要适当，抗原过量时会抑制沉淀的生成。

(三)酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA法）是将酶与抗体(或抗原)结合，制成酶标
抗体(抗原)，将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶
或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后
用特殊分光光度计测定。

此法灵敏度高，特异性强，是抗血清鉴定法中发展最迅速、应用最广泛的方法。

但也存在缺点：①抗体制备所需时间长，费时费力；②
一次只能检测一种病毒，检测多种病毒时灵敏度低；③经常存在假阳性反应，给
脱毒苗检测带来困难。

(四)其他鉴定方法
表
其他
脱毒
鉴定
方法
列举
二
、农
艺
性
状
鉴
定
有些脱毒方法可使脱毒苗产生变异（失真）。

如经热处理后，高温可引起分
生组织细胞突变；经愈伤组织诱导的再生植株脱毒苗，有时会产生染色体变异，导致良种性状的丧失等等。

因此，经过脱毒和脱毒效果鉴定后，还需进行田间农
艺性状鉴定，确证脱毒苗仍保持原品种的特征特性之后，才能作为原原种进行推广。

农艺性状鉴定时，必须采取隔离措施，以免重新感染病毒；鉴定中注意淘汰
劣变植株，保留优良植株；注意发现和选留超越母体植株优良性状的突变体。

第三节脱毒苗的保存与繁育
一、脱毒苗的保存
脱毒苗并非具有额外的抗病性，它们有可能被病毒再次感染。

所以，一旦培育得到脱毒苗，就应很好地隔离与保存。

这些脱毒苗构成的原原种或原种材料，保管得好可以保存利用5~10年。

通常脱毒苗应种植在300目的防虫网内，才能防止蚜虫的进入。

栽培用的土壤应进行消毒，周围环境也要求整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证脱毒苗和脱毒植株是在与病毒严密隔离的条件下栽培繁殖的。

有条件的地方可以到海岛或高岭山地种植保存，那里气候凉爽，虫害少，有利于脱毒材料的生长和繁殖。

另一种更经济实用的方法，是通过组织培养进行繁殖和离体保存，具体见第九章内容。

二、脱毒苗的繁育
脱毒苗的扩繁主要采用无性繁殖方法，如嫁接、扦插、压条、匍匐茎繁殖和微型块茎(根)繁殖等。

从良种繁育的角度考虑，建立一套完整、科学的体系是非常必要的。

我国农作物脱毒苗繁育生产体系见图5-8。

在脱毒苗的繁育体系中，各级分工负责，各司其职，相对独立，又上下衔接，确保脱毒苗的繁育质量和顺利、及时地供应生产。

市售良种经2～3年使用后再度感染，便会影响作物产量和品质，应重新更换和采用脱毒苗，以保证生产的质量。

技能5-1 微茎尖的剥离
技能要求
●掌握微茎尖剥离操作程序
●切取茎尖准确，操作规范、熟练、快捷
●训练前准备
1.材料与试剂
香石竹等各种植物材料的嫩茎、75%酒精、脱脂棉、95%酒精、0.1%次氯酸钠、无菌水、模拟培养基(只加琼脂，已灭菌)等。

2.仪器与用具
超净工作台、医用小剪刀、解剖镜（8~40倍）、解剖刀、解剖针、平底试管、酒精灯、培养皿、滤纸、镊子、磁力搅拌器、烧杯(500 ml、100 ml)、量筒（100 ml）、容量瓶（500ml 、1000ml）、各类移液管、冰箱、标签纸、记号笔等。

所有仪器与用具使用前消毒或灭菌。

●方法步骤
1.切取茎芽
任选几种植物嫩茎，用医用小剪刀剪取3～5cm长、带顶芽或腋芽的短茎10个，去掉叶片，仅保留护芽的嫩叶柄，置于灭菌过的培养皿中。

2.茎芽消毒
用洗涤液或洗衣粉水洗涤，尤其是腋芽的叶柄处用软毛刷涮擦，用清水反复冲洗干净，然后移入超净台，用0.2%次氯酸钠浸渍10min，无菌水冲洗3~5次后备用。

3.剥离茎尖
将芽置于衬有无菌湿滤纸的培养皿内，在解剖镜下，一只手用镊子按住嫩叶柄或芽，另一只手用解剖刀或解剖针将叶片和叶原基层层剥除，到茎尖初露为止，再用解剖刀切下0.3~0.5mm的微茎尖(带2个叶原基)。

选用不同的材料反复练习，达到熟练操作。

●注意事项
1.接种时最好使茎尖向上，不能埋入培养基内。

2.为了防止茎尖变干，应在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内剥离茎尖，而且从剥离到接种的间隔时间越短越好。

整个剥离过程中，要注意常将解剖针和解剖刀蘸入90%酒精中，并用火焰灼烧灭菌，冷却后使用。

3.剥离微茎尖时双眼要同时睁开，调整好解剖镜的焦距，并且手、眼与工具间配合默契。

4.切割微茎尖要用锋利的解剖刀，并做到随切随接。

技能5-2 热处理与茎尖培养脱毒
技能要求
●脱毒方案科学、合理，操作规范、熟练、快捷
●母体植株选择正确，外植体切取恰当，微茎尖剥离准确，大小适宜
●训练前准备
1.材料与试剂
盆栽香石竹或组培苗；75%酒精、脱脂棉、95%酒精、0.1%升汞、2.5％次氯酸钙或次氯酸钠溶液、吐温-40、无菌水、MS母液、激素母液（KT、6-BA、NAA 等）、蔗糖、琼脂、蒸馏水或去离子水、0.1M NaOH、0.1M HCl。

2.仪器与用具
人工气候箱或恒温箱、水浴锅、超净台、解剖镜（8~40倍）、镊子、解剖刀、解剖针、平底试管、酒精灯、培养皿、滤纸、磁力搅拌器、烧杯(500 ml、100 ml)、量筒（100 ml）、容量瓶（500ml 、1000ml）、移液管、标签纸、记号笔等。

所有仪器与用具均消毒或灭菌。

●方法步骤
1.香石竹脱毒方法
按照香石竹脱毒工艺流程操作（图5-9）。

（l）热处理将盆栽植株（定植后 l～2个月）或试管苗（15d苗龄），置于人工气候箱或恒温箱内，在36～38℃下处理2周，或每天在36℃16h和30℃8h处理共30d，光照16h/d，光强为30001x。

（2）消毒选取无病虫害、叶色浓绿的香石竹叶腋间生出的侧芽为外植体，自来水冲洗0.5 h，75％的酒精消毒30s，再用2.5％次氯酸钙或次氯酸钠溶液消毒15 min，取出后用无菌水漂洗4～5次，无菌滤纸吸去多余水分备用。

试管苗不需经过表面消毒。

（3）茎尖剥离在解剖镜下层层剥离叶片使芽体暴露，用解剖针剥掉幼叶，直至只剩下2个最幼小的叶原基。

（4）茎尖培养用刀片切下茎尖（0.3～0.6mm长）放入培养基。

培养基为MS＋6-BAlmg／L＋KTlmg／L＋NAA0.5mg／L或MS + 6-BA0.5~1.0 mg/L + NAA0.2 mg/L。

培养条件为23～25℃，光照16h，光强2000lx。

2～3周进行1次转接，5～7周后可获得小植株，约2个月后长成2~3 cm高、基部带小芽的丛生芽。

(5)分类编号适当扩繁用茎尖产生的试管苗，并严格对每个茎尖形成的无性系进行分类编号，明确种源，以备病毒检测后，及时淘汰带毒无性系。

●注意事项
1.严格按照热处理方案操作，保证热处理温度和处理时间。

2.其他注意事项与技能5-1相同。

技能5-3 脱毒效果的指示植物鉴定法
技能要求
●按病毒鉴定的操作流程操作
●指示植物选择准确，操作规范、准确、熟练、快捷
●汁液涂抹损伤率和嫁接死亡率不超过3%
●训练前准备
1.材料与试剂
苋色藜、EMC系草莓、UC系草莓、King或Ruden等指示植物种子、香石竹和草莓的待检脱毒苗、栽培基质与肥料、各种杀虫剂和杀菌剂等。

2.仪器与用具
300目防虫网室、花盆、研钵、500～600目金钢砂、医用小剪刀、嫁接刀、嫁接夹、塑料条或封口膜、纱布、棉球等。

●方法步骤
1.香石竹试管苗的脱毒鉴定方法
采用汁液涂抹法进行香石竹组培苗脱毒鉴定。

其操作流程见图5-10。

(1)脱毒苗培育与指示植物栽植在防虫网室内，提前播种石竹、苋色藜等指示植物种子，培育实生苗(按常规管理)；按热处理结合茎尖培养脱毒法培育香石竹试管苗(见技能5-2)，作为待检苗。

(2)叶片研磨当指示植物石竹、苋色藜的实生苗苗龄达8~10周时，取香石竹脱毒苗幼叶1~3g置于研钵中，加入10ml水和等量的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），研碎后加入少量600目金钢砂作为摩擦剂，制成匀浆。

(3)汁液涂抹用手指或纱布或棉球蘸取匀浆液轻轻涂抹石竹、苋色藜的叶片表皮接
种。

两种指示植物各涂抹2组，每组5盆。

(4)观察记录汁液涂抹1周后检查新生叶是否产生病斑。

如有枯斑或花叶等症状，说明脱毒效果不佳，需进一步脱毒。

2.草莓试管苗的脱毒鉴定方法
(1)嫩枝(芽)嫁接法嫩枝(芽)嫁接操作工艺流程见图5-11。

提前培育草莓脱毒苗和EMC系草莓、UC系草莓、King或Ruden等指示植物。

当指示植物的实生苗足够大时，取草莓脱毒苗嫩枝(芽)，削成接穗，用劈接法或插接法嫁接在指示植物匍匐茎上。

每种指示植物各嫁接2组，每组5盆，每盆3枝。

1~2月后，观察指示植物新展开的叶片、匍匐茎、老叶上是否出现皱叶、脉结、黄边等病斑。

如发现有病斑，则说明脱毒效果不佳，需再次脱毒。

(2)小叶嫁接法草莓小叶嫁接操作流程见图5-12。

①草莓脱毒苗培育与指示植物栽植同香石竹脱毒鉴定。

②削接穗取待检草莓叶，去两侧小叶，留中央小叶，保留叶柄长约1.5cm，削皮层成楔形。

③“砧木”选择与处理从盆栽生长良好的指示植物(EMC系草莓、UC系草莓、King或Ruden实生苗足够大)挑选健全叶片，剪去中央小叶，用单面刀片自剪口处向下纵切1.5～2crn切口。

④嫁接将待检小叶的叶柄插入切口，用封口膜缠绕包扎嫁接部位，然后用喷雾器向植株喷少许清水，用开有小孔的塑料袋将指示植物罩上。

⑤接后管理将嫁接后的指示植物移至防虫网室，置于散射光下按常规养护。

⑥观察记录在防虫网室内养护10d后去掉塑料袋，观察指示植物新老叶上病斑的有无，并以此作为判定草莓组培苗是否脱毒的重要依据。

●注意事项
1.指示植物和脱毒苗要提前培育。

2.采用汁液涂抹法进行香石竹组培苗脱毒鉴定时，涂抹叶片力度要适当，既要使汁液浸入叶片，又不要使指示植物的叶片受损严重，这样有利于受损部位尽快愈合。

3.削嫩枝(芽)或叶时，要用利刀且动作迅速，尽量使切面保持固有的形状，这样利于接芽与叶片与“砧木”尽快愈合成一体。

为防止干燥，可在接合片涂些凡士林。

技能5-4 脱毒效果的酶联免疫吸附测定法
技能要求
●按酶联免疫吸附测定流程操作，操作规范、准确、熟练
●根据测定结果，能够准确计算，并根据测定和计算的数据分析，得出待检样品是否有病毒的结论。

●训练前准备
1.材料与试剂
待测苹果脱毒苗、山定子实生幼苗无病叶；苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的抗血清、A蛋白和酶标S蛋白、抗体及酶标A蛋白稀释液
(8ml/mlNaCl+0.2mg/mlKH
2PO
4
+2.9 mg/ml Na
2
HPO
4
·12H
2
O+0.2
mg/mlKCl+2%PVP+0.1%牛血清蛋白+0.05%吐温20，pH7.4的缓冲液)、包被液
(0.05ml/L的Na
2CO
3
+NaHCO
3
的缓冲液，pH9.6)、酶作用底物(0.4mg/ml邻苯二胺)、
反应终止液(2mol/L的H
2SO
4
)、95%酒精、蒸馏水等。

2.仪器与用具
酶联免疫检测仪、离心机、冰箱、微孔板(40孔微量聚苯乙烯板，用95％酒精浸泡
2h，蒸馏水冲洗后晾干备用)、研钵、解剖刀、手术剪、移液管等。

●方法步骤。