第五章 基因克隆的载体系统2014

在体外转录克隆基因的质粒载体
多拷贝 多克隆位点 正选择颜色标记lacZ 具有两个噬菌体强启动 子 用于外源基因的高效表 达
lacZ’ PT7
MCS
Apr
pGEM-3Z
2743 bp
PSP6
ori
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒， 不能在同一个寄主体系中稳定地共存的现象，称为质 粒的不相容性. 在细胞的增殖过程中,其中必有一种会 被逐渐地排斥掉,不相容性的质粒组成不相容性群.

ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容
pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容


转染:感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸所感染，随后能产生出正常噬菌 体后代； 感染:病原微生物在寄主组织内立足的状态
复制型DNA(Replicative form DNA ): 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌 体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变 成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制， 这种双链 DNA 称为复制型 DNA 。
（二）质粒载体的构建及类型
1、天然质粒用做克隆载体的局限性 2、质粒载体必须具备的基本条件 3、质粒载体的选择标记 4、不同类型的质粒载体
1、天然质粒用做克隆载体的局限性
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数 低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷， 不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种 野生型质粒为基础进行人工构建
（2）质粒的拷贝数
拷贝数:常指生长在标准培养基条件下,每个细菌细胞中所 含有的质粒DNA分子的数目. 根据质粒在寄主细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒 可分为 松弛型（relaxed control ） : 10~60copies,高拷贝 严紧型（strigent contorl） : 1~几个copies,低拷贝
质粒
pBR322 及其衍生质粒
复制子
pMB1
拷贝数
15～20
pUC 系列质粒及其衍生质粒
突变的 pMB1
500～700
pACYC 及其衍生质粒
p15A
10～212
pSC101 及其衍生质粒
ColE1
pSC101
ColE1
～5
15～20
（3）、质粒的不相容性（plasmids incompatibility)
温和噬菌体:既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期 的噬菌体. 溶源性细菌:具有一套完整的噬菌体基因组的细菌. 溶源化:用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细 菌的过程 整合:噬菌体的DNA被包容在寄主细菌染色体DNA之中,便叫 做已整合的噬菌体DNA 原噬菌体:在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体 DNA,叫原噬菌体,原噬菌体中如有某些基因缺失了,称之为 缺陷性的原噬菌体 lysogenic state :噬菌体侵染宿主细胞后，将 λ 噬菌体基因 组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中， 并随宿主的繁殖传给子代细胞的现象称溶源状态。
噬菌体颗粒的外壳是蛋白质分子, 内部是核酸,常见的是双链DNA 核酸相对分子量相差较大
感染率极高
生命周期可分为溶菌周期和溶源 周期
（一）噬菌体的一般特性 1. 噬菌体的基本功能 2. 结构及核酸类型 3. 噬菌体的感染性 4. 溶菌周期 5. 溶源周期 6. 重组噬菌体的分离
1 溶菌周期 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外 壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体， 释放出大量子代噬菌体。 2 溶源周期 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体 DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。 只有双链DNA的噬菌体才有溶源周期.
2、质粒载体必须具备的基本条件

具有复制起点 具有抗菌素抗性标记 具有若干限制性单一酶切位点(多克隆位
点(mutiple cloning site简称MCS)。

具有较小的分子量和较高的拷贝数
3、质粒载体的选择标记 氨苄青霉素 ( Amp ) 氯霉素 ( Cml ) 卡那霉素 ( Kam ) 链霉素 ( Sm ) 四环素 ( Tet )
二、噬菌体(bacteriophage)载体
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞; 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩 增 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发 成为基因工程的有用载体
噬菌体一般生物学特性
大多数多呈带尾部的二十面体.
如λ 噬菌体,部分为线状体型.如 M13
筛选标记

蓝白斑筛选 插入失活
4、不同类型的质粒载体
高拷贝数的质粒载体 ( Col E1、pMB1):拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝数的质粒载体 ( F因子、pSC101):来自pSC101 拷贝数小于10
表达某些毒性基因
失控的质粒载体 :一类温度敏感型复制控制质粒 插入失活型的质粒载体 :载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
pBR322的优点 ① 具氨苄青霉素和四环素双抗菌素抗性选择标记 ② 分子小，克隆能力大
载体越小越好，>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂
③ 高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy ④ 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合 转移 pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点，能够被ColK质粒编码 的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移。
pBR322 改造而来 通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重 组质粒
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
生物学特性


噬菌体的外型呈丝状
由外壳包装蛋白和(+)DNA组成 基因组为单链DNA; 不裂解宿主细胞，但抑制其生长 DNA上至少有10个基因 不存在包装限制。 M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌，但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌， 颗粒内含有长6407 bp的闭合环状DNA基因组。 M13的侵染周期很短，不需要插入寄主的基因组。M13通过细菌的纤毛 插入大肠杆菌，单链分子作为模板合成互补链，形成双链DNA分子。
第五章 基因克隆的载体系统
概述
1、 载体（vector）概念
能将外源DNA分子携带进入宿主细胞, 并进行复制或表达的工具称为载体。 用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克 隆的DNA分子。 按功能分为克隆载体和表达载体。
载体的功能

运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
２主要构型
SC构型
cccDNA
OC构型
开环DNA
L构型
线性DNA
3 质粒的基本特性
1）自主复制性 复制起始区（replication origin) ： 通常一个质 粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在 一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制 子） 大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源 于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点
如pDF41、pDF42、pBR329
正选择的质粒载体:直接选择转化后的细胞.只有带有选择标记基因的转化菌
细胞才能在选择培养基上生长，如pUR2、pTR262等 体特称为表达载体.
表达型质粒载体:在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应的蛋白质的克隆载
5、常用的大肠杆菌质粒载体
EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Pvu I Pst I Apr Tcr
pBR322 4363 bp
ROI ROP Origin of Replication Hind II
Sal I
Bal I
1）元件来源 复制起点:来源于ColE1 的派生质粒 pMB1 的DNA复制起点 Ampr基因:来源于pSF2124质粒易位子Tn3 的Ampr基因 Tetr基因:来源于pSC101的Tetr 基因
2 载体的特点


能在宿主细胞内独立复制； 有选择标记，易于识别和筛选； 可插入一段较大的外源DNA分子而不 影响自身复制； 有合适的限制性酶切位点
第一节 克隆载体
用于携带DNA片断进入宿主细胞进行复制 或保存的载体称为克隆载体。
主要的克隆载体
质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 单链DNA噬菌体载体 噬菌粒载体 动物病毒
M13载体的构建
在M13基因组中有一段507个核苷酸 区域的间隔序列,称为IS区;在其间插入序 列不受影响 插入LacZ’,编码B-半乳糖苷酶前面146个 氨基酸,含有其操纵基因和启动子区, 插入接头


M13 DNA载体的特点：
优点 有MCS，便于克隆不同的酶切片段 Xgal显色反应，可供直接选择 无包装限制，克隆能力大 可以克隆双链DNA分子中的每一条链 缺点 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降 实际克隆能力小于1500bp
溶源细菌有两个重要特点:


溶源细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种 噬菌体再感染. 抗御同种噬菌体再感染的特性叫 做超感染免疫性. 经过许多世代之后,溶源性的细菌便能开始进入溶 菌周期,这个过程叫做溶源性细菌的诱发
（二）单链DNA噬菌体载体（M13） 1、生物学特性 2、M13克隆体系 3、噬菌体展示载体
一、 质粒载体
（一）质粒一般生物学特性 １质粒的概念

质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并
被稳定遗传的一类核酸分子，并不是细菌生长所必需的，但可以 赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。


质粒常见于原核细菌和真菌中
绝大多数的质粒是DNA型的(酵母的杀伤质粒是一种RNA) 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb
穿梭质粒载体 人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记,可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-动物细胞穿梭载体
（五）质粒载体的稳定性问题
质粒稳定遗传必须的两个条件 （1）每个世代、每个质粒至少要复制一次 （2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细 胞中 1、结构不稳定性:寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组 等都会使质粒发生插入或缺失。 2、分离的不稳定性:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有 获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。 （六）影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢负荷;质粒载体的拷贝数 ;寄主菌的重组体系
（4）可转移性
根据质粒DNA中是否含有接合转移基因分为 接合型质粒（能自我转移） ：又叫自我转移型质粒，除了带有自
我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合 转移的基因。能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细 胞
非接合型质粒（不能自我转移） ：
带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒 接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原
理
Plac
MCS
lacZ
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal
CH 2OH O HO H O OH H H H H OH N
b
Br
a
Cl O
b来自百度文库半乳糖苷酶的a-肽段
Cl Br
N N Cl Br
兰-白斑筛选 如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶） 该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变 蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表 达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。
PUC质粒的优点: 具有更小的分子量和更高的拷贝数 适用于组织化学方法检测重组体 具有多克隆位点MCS区段