缺氧对大鼠心肌细胞系H9C2中HIF-1α、CT-1表达的影响

ｂＬ Ｐ Ｈ Ｈ－ＡＳ转 录因子 家族 。细 胞 内氧 的水 平 能够 调
节 亚 单 位 的稳 定性 、 亚细 胞 定位 和 其促 转 录 的功
２ １ 使 用 Ｃ Ｃ，后 Ｈ Ｃ ． ｏ］ ９ ２细胞 的 增 殖 情 况 对 照
组（ 培养 液 中无 Ｃ Ｃ 模 拟 缺 氧第 １ ２ ３ ４天 后 的 ｏ １） 、、、
摘要 ： 目的
观察缺 氧对大鼠心肌细胞系 Ｈ Ｃ ９ ２细胞 中 ＨＩ一 、Ｔ １的影 响。方法 Ｆ １Ｃ 一
采用 向培养 液 中加氯 化钻
（ ｏ １） Ｃ Ｃ 模拟 缺氧。实 验分 为缺氧组（ 养液 中加 入 １０ ｔ ｏ／ 培 ０ ｍ ｌＬ的 Ｃ Ｃ。 和对 照组 （ ｘ ｏ １） 培养 液 中无 Ｃ Ｃ 。通过 ｏ １） Ｃ Ｋ８试剂盒检测各组 Ｈ Ｃ Ｃ ９ ２细胞 的存 活率 。通过 Ｒ ａ—ｍｅＰ Ｒ检测 Ｈ Ｆ１ｔ Ｃ 一 ｅｌ Ｃ ｉ ｔ Ｉ一Ｏ和 Ｔ １的 ｍ Ｎ Ｒ Ａ水平 ， 过 Ｗｅｔ 通 ｓ — ｅｎｂｏ技 术检测 Ｈ Ｆ１ 和 Ｃ 一 ｒ ｌｔ Ｉ一 Ｔ１的蛋 白质水平 。结果 缺氧 ３ｄ和 ４ｄ ， 后 缺氧组 Ｈ Ｃ ９ ２细胞的存活率较对照组下
１ ２ ５ Ｈ Ｆ１ｔ Ｃ 一 白检 测 ． ． Ｉ ．Ｏ 及 Ｔ １蛋 Ｗｅｔｒ ｌ 法 ｓ ｎ ｂｏ ｅ ｔ
公 司 ； Ｃ 一 剂 盒 购 自广 州 研 创 生 物 技术 发 展有 Ｃ Ｋ ８试
限公 司； Ｉ． 抗 体 ， Ｔ１抗 体 ，ｃｎ抗 体 购 自 Ｈ Ｆ１ Ｃ． ａｔ ｉ
能 ； Ｂ亚单 位 在 细 胞 核 中持 续 表 达 ， 活 性 不 受 而 其
缺氧 的影 响 。仅和 Ｂ亚 单位 结合 后才 能发 挥促 进基
Ｏ Ｄ值分 别 为 ０ ２ ０±０ ０７、．５ ．２ ．０ ０ ３０±０ ０５ ０ ６ ０ ．５ 、． ７ ± ．６ 、．７ ０ ０３， 氧 组 （ ００ ００ ８０± ．５ 缺 培养 液 中加 入 １０ ０
均 由 仪 器 （ Ｂ ｒ ｍ ７ ０ ｅ ｕｎ ｅ ｄ ｔ ｔ ｎ ｓｓ Ａ ＩＰｉ ３ ０ ｓｑ ｅｃ ｅｅ ｉ ｙ— ｓ ｃｏ ｔ 及 自带 的 Ｓ Ｓ软件 自动 完成 。ａｔ ｅ ｍ） Ｄ ｃｉ 为 内 对 ｎ作 照来 评估 Ｈ Ｆ １和 Ｃ 一 ｍＲ Ａ 的表 达 。 Ｉ． Ｔ１ Ｎ
血／ 缺氧 情况 下产 生 的一种 核转 录 因子 ， 可促进 下游
鼠心肌 细 胞 系 Ｈ Ｃ ９ ２购 自上 海 越 研 生 物 科 技 有 限
公司。
缺 氧反 应基 因如 促 红 细 胞 生成 素 （ Ｐ 、 管 内 皮 Ｅ Ｏ） 血 生 长 因子 （ Ｅ Ｆ 、 Ｖ Ｇ ） 细胞 周期 素 Ｇ 、 红 素氧 合 酶一 ，血 １ （ ．） 诱 导型 一氧 化 氮合 酶 （Ｎ Ｓ 等 的表达 ， ＨＯ １ 、 ｉＯ ） 增 强 组织 细胞 抵抗 缺 血 、 氧 的 能力 ， 。Ｈ Ｆ １由 仅 缺 ２ ｊ Ｉ一
１ ３ 统计 学方 法 ． 采 用 Ｓ Ｓ １． Ｐ Ｓ １５软件 包对 实验 数 据 进行统 计 学处 理 ， 对组 间 比较 采 用 ｔ 验 ， Ｐ 配 检 以 ≤０ ０ ．５为有 统计 学差 异 。
２ 结果
氧是 机 体 维 持生 存 的 必要 因素 ， 体 或 局部 缺 整
氧 会 引起机 体 产生 一 系 列 适 应性 反应 ， 这些 反应 与 缺氧 诱 导 产 生 的 ＨＩ． 切 相 关 ， Ｉ 一 为 一 种 Ｆ １密 Ｈ Ｆ１作 转 录因子 可调 节一 系列 基 因的转 录 ， 而 维持 机 体 从 的功 能 。 Ｈ Ｆ １的 仅 和 Ｂ两 个 亚 单 位 都 属 于 Ｉ．
山东 医药 ２ １ ０ ２年第 ５ 第 ２ ２卷 ０期
・
基础 研 究 ・
缺 氧 对 大 鼠心 肌 细 胞 系 Ｈ ９ ２中 Ｈ Ｆ １Ｌ Ｃ Ｉ 一Ｏ、 Ｃ 一 达 的影 响 Ｔ １表
王 晗。 符史 干 ， 战玲 ， 闽广 ， 董 许 王 杨， 陈国斌 ， 凌峰 高
（ 南医学 院生理 学教研 室 ， 口 ５ １０ ） 海 海 ７ １ １
试 剂盒检 测 。种植 于 ９ ６孔 板 的 细胞 ， 照 每 孔 １０ 按 ０
Ｓ Ａ ３ ＭＡ ＫＭＥ ／ Ｒ Ｐ３Ｋ Ａ ｔ 信号 途 径 发 Ｔ Ｔ 、 Ｐ ． Ｋ Ｅ Ｋ、Ｉ．／ ｋ 等
挥 保 护 心 肌 细胞 的作 用 。缺 氧 时 Ｈ Ｆ １与 Ｃ 一 Ｉ一 Ｔ １的
培 养基 加入 １ ＬＣ Ｋ８溶液 的 比例进 行孵 育 ， ０ Ｃ 一
氧组 Ｏ Ｄ值 都呈 上 升趋势 ， Ｃ Ｃ， 拟 缺 氧第 １２ 加 ｏＩ模 、
天后 Ｏ Ｄ值 与 对 照 组 无 统 计 学 差 异 （ ＞ ． ５ ， Ｐ ０ ０ ） 加
Ｃ Ｃ 第 ３ ４ 天 后 Ｏ 值 较 对 照 组 降 低 （ 均 ｏ１ 、 Ｄ Ｐ
＜ ．５ 。 ０ ０ ）
２ ２ Ｈ Ｆ １ Ｃ 一 ｍＲ Ａ表 达 ． Ｉ． 及 Ｔ １ Ｎ
ｌｔ Ｃ 一 表 达 增 加 。 Ｏ和 Ｔ１的
关键词 ： 缺氧诱导 因子一Ｏ； １ｔ 心肌 营养 素一 ； １缺氧心肌
中 图分 类 号 ：７ ８ Ｒ ３ 文 献 标 志码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ２２ ６ ２ １ ） ００ ３ －３ １０ －６ Ｘ（０ ２ ２ － ００ ０
缺 氧 诱 导 因 子 （ Ｆ１ 是 哺 乳 动 物 细 胞 在 缺 ＨＩ．）
２ｈ后检测 ０ ４ ０ Ｄ５ 。
１ ２ ４ Ｈ Ｆ１ｔ Ｃ ． ｍＲ Ａ 检 测 Ｒ ａ．ｍｅ ． ． Ｉ ．Ｏ 及 Ｔ １ Ｎ ｅ１ ｉ ｔ
关 系 尚不清 楚 ，００年 １月 ～ ０ １年 ４月 我们 检测 ２１ ２１
了缺 氧 时 大 鼠 心 肌 细 胞 系 Ｈ Ｃ ９ ２中 Ｈ Ｆ １和 Ｃ ． Ｉ一 Ｔ１ 的表达 情况 ， 而 为探 讨 缺 血心 肌 中 ＨＩ一 从 Ｆ １与 Ｃ ． Ｔ１
ＳｎａＣｕ 公 司 ；Ｃ ａｔ ｒｚ Ｐ Ｒ相 关试 剂 购 自博 大 泰 克公 司 ； 氯 化钴 （ ｏ １） Ｃ Ｃ 购于 海南 青鸟 生物科 技 有 限公 司 ； 大
基金项 目： 海南省 自然科学基金资助 项 目（ ００ ５ 海南省 教育厅高 ３９ ３ ）； 校科研基金资助项 目（ ｊｊ０ ９５ ） ｎｋ２ ０ －５ 。
Ｃ Ｃ 拟 缺 氧 后 ， ９ ２细 胞 中 ＨＩ一仅的 蛋 白水 ｏ １模 ＨＣ Ｆ１ 平增 加 ， Ｈ Ｆ １ 的 ｍ Ｎ 水 平 与 常 氧 比较 没 有 而 Ｉ． ＲＡ 变化 ， 与理 论上 保 持 一 致 。据研 究 表 明 ， Ｉ 一 在 这 Ｈ Ｆ１ 心肌 缺 血 时 主 要 通 过 促 进 Ｅ Ｏ、 Ｅ Ｆ Ｈ ． 、Ｎ Ｓ Ｐ Ｖ Ｇ 、 Ｏ １ ｉＯ 等基 因的表达 发 挥代 偿 作 用 。除 此 之外 ， 心肌 在
￣ ｏ Ｌ的 Ｃ Ｃ， 分 别 为 ０ ２ ０±０ ０ ４、 ． ６ ｍｌ ／ ｏ Ｉ） ．２ ． １ ０ ３ ０±
０ ０ ８ ０ ５ ０± ． ４ 、 ． ０ ０ ０ １ ． ２ 、 ． ３ ０ ０ ７ ０ ７ ０± ． ５ 。对 照 组 和 缺
因转 录 的作用 。在 常氧 情 况 下 ， 仅亚 单 位 能通 过 肿 瘤 抑 制 蛋 白介 导 的泛 素一 蛋 白酶途 径 被 迅速 降解 ， 而缺 氧 能 阻 断 这 一 途 径 ， Ｈ Ｆ１ 单 位 稳 定 下 使 Ｉ．仅 来 Ｊ 因此 ， 研 究 中 向培 养 液 中加 １ ０ ｍｏ Ｌ 。 本 ０ ｌ ／
亚 基 和 Ｂ亚基 组成 ， 中对 Ｈ Ｆ１活性 的调 节 主 要 其 Ｉ． 通 过 Ｏ 亚 基 。心 肌 营养 素 － （ Ｔ １ 是 新 近 发 现 的 Ｌ １ Ｃ ．）
一
１ ２ 实验 方法 ．
１ ２ １ 细 胞 培 养 与 低 氧 孵 育 大 鼠 心 肌 细 胞 系 ． ．
ＨＣ ９ ２使用 Ｄ Ｍ 培养液 （ 入 １ ％胎 牛 血 清 ）放 ＭＥ 加 ０ ，
心肌 缺氧 ， 体外 ， 在 缺氧 的环 境可 以通 过使 用低 氧孵 箱 和使 用 Ｃ Ｃ 实现 ｌ 。本 研究 采 用 向培 养 液 中 ｏ １来 ３ Ｊ
加 １ ０￣ Ｌ ＬＣ Ｃ 拟 缺氧 。结 果显示 Ｃ Ｃ ０ ｍｏ ／ ｏ １模 ｏ １ 模
隆抗 体 （ ： ０ ） 室 温摇 床 孵 育 ２ｈ 应 用 辣 根 过 氧 １ ５０ ， ，
缺 氧 环 境 下 大 鼠心 肌 细 胞 系 Ｈ Ｃ ９ ２中 Ｈ Ｆ Ｉ—
降 （ ０ ０ ） 缺氧后 Ｈ Ｃ Ｐ＜ ．５ ， ９ ２细胞 中 Ｈ Ｆ １ｔ Ｎ Ｉ 一ＯｍＲ Ａ表达无 明显 改变（ ０ ０ ） 而蛋 白表达 增加 （ ０ ０ ） Ｐ＞ ．５ ， Ｐ＜ ． ５ 。缺氧
后ＨＣ ９ ２细 胞 中 Ｃ 一 ｍＲ Ａ 和 蛋 白水 平 均 增 加 （ Ｔ１ Ｎ Ｐ均 ＜ ．５ 。 结论 ００ ）
化 物酶标 记 的羊抗 鼠多克 隆抗 体 （ ： ０ ） 温 孵 １ １０ ０ 室
拟 的缺氧 环境 使心 肌细 胞 系 Ｈ Ｃ ９ ２存 活 率较 常 氧 时
下降 。
育 １ｈ再 加入 化 学发 光 显 色 剂 显 色 ， ， Ｘ光 片曝 光 显 影， 凝胶 成像 分析 系统 扫 描 。Ｃ ． 白水平 检 测 方 Ｔ１蛋 法 同 ＨＦ１ ｃｎ作 为 内对 照 。 Ｉ．。ａｔ ｉ
３ ０
检 测缺 氧前 后 Ｈ Ｃ ９ ２细胞 中 Ｈ Ｆ １【 Ｃ 一 Ｉ 一ｏ 和 Ｔ １的蛋 白 表 达量 的 变 化 。Ｃ Ｃ：处 理 ４ ｏＩ ８ ｈ后 收 集 细 胞 ， 冷
山东 医药 ２ １ ０２年第 ５ 第 ２ ２卷 ０期
Ｐ Ｓ洗涤 ， Ｂ 加人 细 胞 裂 解 液各 ２ ０ Ｌ 经 ８ Ｓ Ｓ ０ ， ％ Ｄ 一 聚丙 烯酰 胺凝 胶 电泳 分离 ， 转移 到 硝酸纤 维 素膜 ， 蛋 白封 闭液 ４℃封 闭膜 过夜 ； 加入 鼠抗 人 Ｈ Ｆ １ Ｉ一仅单 克 研 究 者们 努力 寻找新 的治疗 靶点 。心 肌缺 血会 导致
１ 材 料 与方 法
Ｒ Ａ提 取采 用 Ｔ Ｉｏ 试 剂 提取 法 ， 体 方法 参 照说 Ｎ Ｒ ｚｌ 具
１１ 材料 ．
Ｄ Ｍ 培 养 基 、Ｒｚｌ 自 Ｉｖｔｇｎ ＭＥ ＴＩ 购 ｏ ｎｉｏｅ ｒ
明书 。Ｒ Ａ 经 逆 转 录 反 应 合 成 ｃ Ｎ Ｒ ａ．ｍ Ｎ Ｄ Ａ， ｅ１ｉｅ ｔ Ｐ Ｒ扩增 过程及 荧光 信 号 检 查 、 据 的储 存 和 分 析 Ｃ 数
Ｐ Ｒ法检测 缺 氧前 后 Ｈ Ｃ Ｃ ９ ２细 胞 中 Ｈ Ｆ １ｔ Ｃ ． Ｉ．Ｏ 和 Ｔ １
的基 因水 平 。Ｃ Ｃ，处 理 Ｈ Ｃ ｏ１ ９ ２细 胞 ４ ８ ｈ后 提 取 Ｒ Ａ检 测 Ｈ Ｆ １ｔ Ｃ 一 Ｎ Ｉ 一Ｏ 和 Ｔ １的 基 因表 达 量 。细 胞 总
的关 系提供 方法 与思 路 。
×１ 。 ±０ ０
．
缺 氧 组 和对 照组
ＨＣ ９ ２细胞 中 Ｈ Ｆ １ Ｒ Ａ都有 表达 （ 别 为 ２ ９ Ｉ．仅ｍ Ｎ 分 。０
００５和 ２７ ０ ．２×１ ± ．０ ）但 缺 氧 时 ０ ０ ００６ ，
缺血 缺 氧 时 ， Ｉ． 是 否 还 可 以通 过 促 进 其 他 与心 Ｈ Ｆ１ 肌保 护 密 切 相 关 因 子 的 表 达 发 挥 代 偿 作 用 ， 得 值
置于 ３ ７℃ 、％ Ｃ ， ５ Ｏ 孵箱 中。低 氧 环境 通 过在 培养 基 中加入 Ｃ Ｃ ， ｏ １ 实现 。
１ ２ ３ 细 胞活性 检测 ． ． ＨＣ ９ ２细胞 活性 通过 Ｃ Ｋ ８ Ｃ．
种 细 胞 因 子 ， 于 Ｉ－ 超 家 族 ， 通 过 Ｊ Ｋ 属 Ｌ６ 可 Ａ／