胰岛自身抗体检测技术新进展

胰岛自身抗体检测技术新进展

1型糖尿病(TIDM)患者血清中存在多种自身抗体(即胰岛自身抗体)，如胰岛细胞抗体(ICA)、谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体2(IA-2A)、胰岛素自身抗体(IAA)、锌转运体8自身抗体(ZnT8A)等等。检测这些自身抗体对于T1DM的发病预测、诊断和鉴别诊断、治疗监控和预后评估有着重要的临床意义。由于ICA检测难以标准化，目前应用受到限制。而GADA和IA-2A检测方法经历的多次改良和标准化，目前已能为临床诊断和治疗监控、以及发病预测提供有力的佐证。

先前的检测方法经历了免疫印迹法、免疫荧光法、免疫沉淀酶活性分析法等，终因操作繁琐耗时，灵敏度和特异性差而极少应用于临床。目前国内外临床应用得较多的是酶联免疫吸附分析法(ELISA)和放射免疫分析法(R1A)，国际标准化的检测方法是放射配体法(RLA)。

1．酶联免疫吸附法分析法

酶联免疫吸附法分析法(ELISA)检测GADA和IA-2A在国内外各级医院应用较广，目前检测法主要基于3种不同原理设计。

①包被抗原法(直接法)

将GAD抗原加入到96孔酶免板的微孔内，室温放置过夜。然后各孔加入封闭液，再次室温放置过夜。洗涤，加入稀释过的血清，室温反应60min，洗涤，加入连接碱性磷酸酶的羊抗人免疫球蛋白抗体，室温反应60min，洗涤。加入对硝基苯酚磷酸盐溶液，37℃作用30min，加入NaOH溶液终止反应。在酶免仪上于405nm处检测吸光度，与标准品对照，即可知待测血清GADA水严。因反应模式限制，该方法最终灵敏度和特异性不高。

②包被抗体法(间接法)

将GADA(1A-2A)单克隆抗体包被于96孔微量滴定板内，洗涤，加入纯GAD(或IA-2)抗原，4℃避光固定过夜。洗涤，加入预稀释的血清，室温作用90min，再加入连接碱性磷酸酶的抗人免疫球蛋白，室温作用60min。洗涤，加入对硝基苯酚磷酸盐溶液，37℃作用15min，加入NaOH溶液终止反应。在酶免仪上，于405nm处检测吸光度，与标准品对照，即可知待测血清GADA(或IA-2A)水平。该方法与直接法相比，灵敏度和特异性有所提高。

③应用亲和素和生物素放大系统的ELISA法

亲和素一生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，应用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素一生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素一酶结合物，以放大反应信号。

“前放大”模式是放大了抗原包被量或使抗原表位充分暴露。其原理是：第一步GAD —生物素(IA-2-生物素)与抗生蛋白链菌素包被的微孔板结合，洗涤后，与样品中GADA(或IA-2A)结合。清洗后，过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG 与GAD(或IA-2)抗体结合。HRP复合物与ABTS底物反应并检测吸光度。颜色的深浅反映了GADA(或IA-2A)水平。该方法灵敏度和特异性好，与标准的放射配体检测法结果判定上总体一致性良好，特别对厂低抗体水平的正常人标本以及高抗体水平的T1DM标本符合率高。

“后放大”模式是放大了显色信号。其原理是：将GAD(或IA-2)抗原包被在ELISA 板上，与血清中的GADA(或IA-2A)结合，洗涤，再加入结合生物素的GAD(或IA-2)与固定好的复合物结合。这样GAD(或IA-2)—BIOTIN与GADA(或IA-2A)水平成正相关。加入链酶素过氧化物酶结合，再加入底物TMB显色，读取450nm F的吸光度，与标准曲线对照，即可得到血清中的GADA(或IA-2A)水平。该方法批内CV为2.4-4.2%，批间CV 3.8-25.6%，灵敏度和特异性好。

这两种放大模式原理不尽相同，但在操作程序上有很多相似之处：都采用了温育振荡方式(﹥200RPM)进行抗原抗体反应，这样能提高抗原抗体分子接触的机会，使检测灵敏度提高。同时洗板是两种方法的关键步骤，如果清洗不充分会导致检测精密度下降和本底吸光度上升。我们的研究显示不同原理设计的ELISA试剂盒检测灵敏度和特异性有显著差别。

2．放射免疫分析法

放射免疫法检测GADA和IA-2A主要采用采用氯胺T标记法，用125I标记GAD(或IA-2)与血清在分析缓冲液中4℃作用过夜。加入蛋白A—琼脂糖后于4℃放置1h，沉淀经洗涤3次后进行放射计数。以阳性参考血清为标准，待测血清的活性定义为阳性血清的沉淀计数百分率。Masuda等采用此方法检测了217例不同年龄与病程的IA-2A，发现阳性率为

47%(103/217)，其中新发病的TIDM 阳性率57%(64/113)。有2.5%(1/40)的Grave's 病患者用此方法检测山IA-2A 阳性，T2DM患者IA-2A阳性率2.5%(5/204)。该方法与标准的放射配体检测法结果相关系数r为0.78。我们的研究显示采用RSR放射免疫试剂盒检测GADA与放射配体法—致率达79.3%。由于采用氯胺T标记法前，必须获得高纯度及高活性的胰岛自身抗原。且在标记过程中，有可能导致胰岛自身抗原的损伤或空间构象的改变，从而降低方法的灵敏度，故该法较少应用标准化分析。

3．放射配体检测法

主要检测方法是采用人GAD65(或IA-2)cDNA插入到原核表达质粒pcDNAⅡ SP6启动子下，构建重组质粒，并转化宿主菌E．coli．DH10B后，通过原位杂交筛选出含重组质粒的阳性菌落，碱法提取质粒进行酶切和测序鉴定。将连接正确的重组质粒在转染的E．coli．DHl0B中繁殖扩增，并抽提纯化质粒。GAD65(或IA-2)的质粒在无蛋氨酸的兔网织红细胞裂解液体系中，加入35S标记蛋氨酸(35S-Met)，经由体外转录/翻译直接得到35S标记GAD65(1A-2)抗原。采用Sephadex柱凝胶层析或三氯醋酸(TCA)沉淀等方式去除游离的

35S-Met。35S标记GAD65(IA-2)与血清旋转孵育后，用蛋白A-琼脂糖沉淀抗原抗体复合物。