康普瑞汀磷酸二钠的抗血管生成作用

· 930 ·
江苏医药 2009 年 8 月第 35 卷第 8 期 Ji ang su M ed J , A ugu st 2009 , V ol 35 , N o .8
1 m l 不含或含有 CA4P(1 μg/ m l 、0.2 μg/ m l 和 0.04 μg/ m l)的培养液 。每 2 天换液 1 次 , 7 d 后 , 拍照 , 观察药物作用 。共 4 个组 , 对照组 , CA 4P 1 μg/ ml 、 0.2 μg/ ml 和 0.04 μg/ ml 组 。CA4 P 使用 M 199 培 养基溶解 。
作 者单位 :210008 南京 医科 大学 附属南 京儿 童医 院药 剂科 (景 霞 、李 燕);中国药科大学 江苏省肿 瘤发生与 干预重点 实验室 (卢 娜 、郭青龙)
责任作者 :郭青龙 E-mai l :qinglongguo @h otmail .com
所 。雄性 SD 大鼠 3 只 , 6 周龄 , 体重 150 ～ 170 g , 由 中国药科大学实验动物中心提供 , 实验动物生产合 格证号 :SCXK(苏)2002-0011 ;9 日龄 SP F 级鸡胚购 自南京生物药厂 。
二 、方法 1.受精鸡胚置于孵化箱中 孵化 。 然后将鸡胚 用酒精擦拭 后静置 15 m in , 在 鸡胚的 上方划 一个 2 cm ×2 cm 大小的开窗位置 , 揭去开窗处的蛋壳 , 再用虹 膜剪 刀剪 破壳 膜 , 暴 露出 绒毛 尿囊 膜 。 将 15 μl CA4 P (0.6 mg/ ml 、 0.2 mg/ ml 和 0.067 m g/ m l)或 PBS 加在 Whatm an 滤纸上 , 然后将滤纸 放在绒毛尿囊膜两条大血管间的无血管部位 , 用灭 菌透明胶带封窗 , 放入 37 ℃孵箱孵育 。 共 4 个组 , 对照组 , CA 4 P 1 μg 、3 μg 和 9 μg 组 , 每组 10 个鸡 胚 。CA 4P 使用 PBS 溶解 。 2.体重 150 ～ 170 g 的雄性 SD 大鼠一只 , 脱臼 法处死 , 取胸主动脉 , 剪成长约 1 m m 的动脉环 , 用 M 199 无血清 培养液 漂洗 。 将 凝血酶事 先加入 24 孔培养板中(0.01 U/ μl), 然后加入900 μl纤维蛋白 胶(M199 培养基 +0.3 %纤维 蛋白原 +0.5 %氨基 己酸), 再将动脉环放入 , 待胶凝固后 , 在每孔中加入
通过特异性的与血管内皮细胞的骨架蛋白 tubulin 的结合 , 扰乱内皮细胞的骨架结构 , 使细胞的形态和 功能都受到影响 , 血管结构被破坏 , 从而切断了肿瘤 细胞的营养供应 , 使肿瘤组织坏死[ 3] 。有的文献报 道说 , 这种独特的破坏作用实际上是一种血管结构 的退化[ 4] 。从我们的结果来看 , 这种对于血管的破 坏作用确实存在 , 而且不仅如此 , 无论是内皮细胞的
4.将 mat rigel 铺 到 96 孔 板 上 , 80 μl /孔 , 37 ℃, 放置 30 m in 使其凝固 。将内皮细胞给予 CA 4 P(0.025 μg/ ml 、0.1 μg/ ml 和 0.4 μg/ ml)30 min , 然 后消化细胞 , 用培养基重悬细胞 , 计数 , 然后每孔加 入 1 ×105个/ m l 内皮细胞悬液 100 μl 和 10 n百度文库/ ml V EG F 。于 5 % CO 2孵箱 37 ℃培养 8h 后在相差显 微镜(×100)下观察小管生 成情况并拍照 。 CA 4 P 使用 1640 培养基溶解 。
结果
一 、CA 4P 抑制鸡胚尿囊膜血管生成 鸡胚放入孵化箱中孵化两天后 , 揭去封窗的透 明胶带 , 用数 码 相 机 拍照 。 与 对 照 组 比较 , 给 予 CA 4 P 后 , 血管生成受到抑制 , 表明 CA 4 P 可以抑制 鸡胚尿囊膜血管 , 并呈剂量依赖性(见插页 2 图 1)。 二 、CA 4P 抑制大鼠动脉环血管生成 内皮细胞从动脉段切口处向外生长 , 形成具有 分枝的微血管样结构 。 7 d 后于倒置显微镜下观察 动脉环附近内皮细胞和新生血 管的生成情况 并拍 照 。 与对照组比较 , 给予 CA 4P 后 , 动脉环的毛细血 管样结构受到破坏 , 说明 CA 4 P 破坏大鼠动脉环微 血管样结构 , 并呈剂量依赖性 。 三 、CA 4P 抑制内皮细胞运动 4 h 后 , 取出 t ransw ell 小室 , 刮去膜上未迁移细 胞 , 然后将滤膜剪下来 , 用 100 %甲醇固定滤膜 , 并 以苏木精 -伊红染色 , 甘油封片 , 最后利用显微镜观 察并拍照 。与对照组相比 , 给予 CA 4 P 后 , 内皮细胞 的迁移能力受到抑制 , 说明 CA 4 P 可以抑制内皮细 胞的运动 , 并呈剂量依赖性(见插页 2 图 2)。 四 、CA 4P 抑制内皮细胞小管生成 内皮细胞在 m at rigel 中生长 8 h 后 , 细 胞会由 原来的多角形变成长梭形 , 并向凝胶基质中延伸生 长 , 呈线形排列而形成管状结构 , 多个小管相互连接
因此, 从以上的结果和分析来看, 我们认为 CA 4P 通过靶向血管内皮细胞 , 破坏血管来达到抑 制血管和抗肿瘤的作用 。
参考文献
[ 1] T ozer G M , Pri se V E , Wil son J , et al .Combret as tati n A-4 phosphat e as a tum or vascu lar-t arget ing agent :early ef f ect s in t umors and normal t is sues[ J] .Cancer Res , 1999 , 59(7):16261634 .
运动功能还是形成网络结构的功能也同时受到了影 响 , 我们认为这种作用可能也是因为细胞骨架蛋白 的影响而造成的 。(3)体外实验证明 CA 4 P 能够抑 制生长因子诱导的内皮细胞的增殖和迁移 。
Ⅰ 期临床同时还表明 , CA 4 P 相对其它的细胞 骨架抑制剂 , 具有更小的毒性和更广的治疗范围 , 对 于临床实践具有一定的指导意义 。
【Key words】 Combretastain A 4 phospha te ;Ca ncer ;A ng iog ene sis [ Jiangsu Med J , August 2009 , 35(8):929-930.]
恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于 血管生成(angio genesi s), 抑制血管生成能显著地抑 制肿瘤的生长 。 抗血管生成是不同于常规抗肿瘤治 疗的新策略 , 并以成为肿瘤研究的热点之一 。 康普 瑞汀磷酸二钠(CA 4 P)系从非洲植物中提取出的血 管损伤剂(VDA)类抗肿瘤药前体 。 我们研 究了其 对体内外血管生成的影响 。
3.将内皮细 胞给 予 CA 4 P (0.025 μg/ ml 、0.1 μg/ m l 和 0.4 μg/ m l)30 min , 然后消化细胞 , 用培养 基重悬细胞 , 计数 , 将 2.5 ×105 个/ ml ECV 304 细胞 悬液 400 μl , 加 入 到 上 室 , 下 室 加 入 600 μl 含 10 ng/ m l的 V EG F 的 1640 培养液 , 于 5 %CO 2孵箱 37 ℃中培养 4 h 。 CA 4 P 使用 1640 培养基溶解 。
【Abstract】 Objective T o asse ss the effects o f co mbretastain A4 pho sphate o n angioge nesis . Methods T he angiogenetic effects of combretastain A 4 pho sphate w ere inv estiga ted w ith chicken cho rio allanto ic membrane (CA M)assay , rat aor tic ring assay , endothelial cell mig r ation assay and tube forma tion a ssay .Results Combre tastain A 4 phosphate inhibited the vessel g row th in CA M and micro vessel sprouting fro m rat aor tic ring s and the va scular endothelial g row th facto r (VEG F)stimulated mig ratio n and tube for mation o f human umbilical vein endo thelial cellline (ECV 304) in a do se-dependent manne r .Conclusion Combretastain A 4 pho sphate may inhibit angio genesis .T he molecula r mechanism needs to be studied further .
【关键词】 康普瑞汀磷酸二钠 ;肿瘤 ;血管生成 【中图分类号】 R735 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-3685(2009)08-0929-02
The anti-angiogenesis ef fect of combretastain A4 phosphate JI NG Xia , L U Na , GUO Qinglong , et al . Affiliated Nanjing C hildren′s Hospital , Nanjing Medical University , Nanjing 210008 , CHI N A
江苏医药 2009 年 8 月第 35 卷第 8 期 Ji ang su M ed J , A ugu st 2009 , V ol 35 , N o .8
· 929 ·
康普瑞汀磷酸二钠的抗血管生成作用
· 论著 ·
景 霞 卢 娜 郭青龙 李 燕
【摘要】 目的 观察康普瑞汀磷酸二钠 对血管生 成的影 响 。 方法 采用 鸡胚尿 囊膜体 内试验 模型 、大鼠动脉环体外试验模型 、内皮细胞运动 性试验 和小管 生成试验 考察康 普瑞汀 磷酸二 钠的抗 血管生成作用 。 结果 康普瑞汀磷酸二钠可以 抑制鸡 胚尿囊 膜血管及 体外培 养的大 鼠动脉 环微血 管样结构 , 还可以抑制血管内皮细胞的运 动及血 管网络 状结构 形成 , 并呈剂 量依赖 性 。 结论 康普 瑞汀磷酸二钠可以抑制血管生成 , 但作用机制 需要进一步研究 。
形成三维网状结构 , 在倒置显微镜下观察 、拍照 。与 对照组相比 , 给予 CA 4 P 后内皮细胞网络状结构受 到破坏 , 说明 CA 4P 可以抑制内皮细胞小管生成 , 并 呈剂量依赖性(见插页 2 图 3)。
讨论 CA 4P 抗血管作用的机制研究的实验研究结果 表明 :CA 4P 可以抑制 鸡胚尿囊膜血管及体外培养 的大鼠动脉环微血管样结构 , CA 4 P 还可以抑制血 管内皮细胞的运动及血管网络状结构形成 , 并呈剂 量依赖性 。CA 4 P 作为一个化学小分子的肿瘤血管 抑制剂 , 其对肿瘤的抑制及其血管的破坏作用有其 独特的优势 。(1)首先 , 它能够靶向性的作用于血管 内皮细胞 , 而对 于其它 细胞 的存在 和发 展没 有影 响[ 1 , 2] 。(2)与通常的抑制血管药物不同的是 , CA 4 P
材料与方法 一 、材料 康普瑞汀磷酸二钠(CA 4 P)(成都恒基医药科技 有限 公司), 使 用 前 用 P BS 配 成 所 需 浓 度备 用 。 T ransw ell 小室(Millipore)。 Mat rigel(BD 公 司)。 VEGF (Chemicon 公 司)。 RPM I-1640 培 养 基 、 M199 培养基 、胎牛血清和小牛血清(Gibco 公司)。 纤维蛋白原 :购自 Sigm a 公司 。 凝血酶和氨基己酸 (Si gma 公司)。 ECV304 内皮 细胞 购自 上 海细 胞