酶的提取和分离纯化
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提取与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
在低浓度的盐存在的 条件下，酶的溶解度 随盐浓度的升高而增 加，这称为盐溶现象。
在盐浓度达到某一界 限后，酶的溶解度随 盐浓度升高而降低， 这称为盐析现象。
3.3 酶的提取
❖影响因素
主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的溶 解度
酶向溶剂相中扩散速度 另外：温度-适当提高温度
改变条件、添加物质
分离
降低酶的溶解度
酶、杂质
❖机理
3.4.1 沉淀分离
沉淀分离方法
分离原理
盐析沉淀法
不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性， 通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从 溶液中析出沉淀
等电点沉淀法 两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性
电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH 值，使酶或杂质沉淀析出
3.3 酶的提取
❖方法
提取方法
使用的溶剂或溶液
提取对象
盐溶液提取 0.02～0.5mol/L
盐溶液
酸溶液提取 pH2～6
水溶液
碱溶液提取 pH8～12
水溶液
有机溶剂提取 与水混溶的有机
溶剂
提取在低浓度盐溶液中溶 解度较大的酶
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶
提取在稀碱溶液中溶解度 大且稳定性较好的酶
Chapter 3 The Extraction, Separation and
Purification of Enzyme
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
Contents of chapter 3
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
+
+
+
+
革兰氏阳性球菌 +
-
+
+
菌丝
-Fra Baidu bibliotek
++ - ++
孢子
-
-
-
-
3.3 酶的提取
❖定义
指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处 理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过 程。
❖目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
❖原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
pH值-避开酶的等电点 提取液体积-为原料体积的3～5倍， 分几次提取
适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂
3.4 酶的分离方法
3.4.1 沉淀分离 3.4.2 离心分离 3.4.3 过滤与膜分离 3.4.4 层析分离 3.4.5 电泳分离 3.4.6 萃取分离
3.4.1 沉淀分离
❖定义
是通过改变某些条件或添加某种物质， 使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出， 与其它溶质分离的技术过程。
物
菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚/ nm
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
100 ~ 300
100 ~ 250
层次
单层
多层
多层
多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖
胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖
(5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖
(11% ~ 22%) 磷脂
蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 甘露聚糖(30%) 几丁质(1% ~ 2%) 蛋白质(6% ~ 8%)
有机溶剂沉淀法 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加
一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，
复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀
下来
选择性变性沉 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，
淀法
而不影响所需的酶
3.4.1 沉淀分离
❖盐析沉淀法
盐浓度（中性盐） 离子强度
3.2 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高 压
为了提取这些胞内酶，
细 胞
首先需要对细胞进行
破
破碎处理。
碎 机
(1)机械破碎
(2)物理破碎
细胞
破
(3)化学破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
碎 珠
(4)酶解破碎
❖各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性细 革兰氏阴性 放线
Ks分段盐析、β分段盐析
饱和度 温度-室温 pH-欲分离酶的等电点
3.4.1 沉淀分离
❖等电点沉淀法
等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。
在加酸或加碱调节pH值的过程中， 要一 边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱 而引起的酶变性失活。
3.4.1 沉淀分离
❖有机溶剂沉淀法
有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲 醇 用量一般为酶液体积的2倍左右 分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶 液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。
1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取(重点) 4、酶的分离方法(重点) 5、酶的组合分离纯化策略 6、酶的浓缩、干燥与结晶
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
动物、植物或微生物细胞
酶提取 发酵液
酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分离， 层析分离，电泳分离，萃取分离， 结晶分离等。
❖依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
❖常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
通过各种化学试剂对细胞膜的作 用，而使细胞破碎
有机溶剂： 表面活性剂
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用，使细胞外层结构 受到破坏，而达到细胞破碎
自溶法 外加酶制剂法
❖细胞对破碎方法的敏感性
细胞
声波 机械 渗透压 温度差
动植物
+++ +++ +++ +++
革兰氏阴性菌
++ ++ ++ ++
脂类(8.5% ~ 13.5%)
多聚糖
(80% ~ 90%) 脂类
蛋白质
❖细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切力，使 组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
化学破碎
3.4.1 沉淀分离
❖复合沉淀法
常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、 聚丙烯酸等高分子聚合物。
❖选择性变性沉淀法
加热、改变pH值、加进某些金属离子， 使杂蛋白变性沉淀除去。
对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂 质的种类，含量及其物化性质有比较全面 的了解。
3.4.2 离心分离
❖定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在低浓度的盐存在的 条件下，酶的溶解度 随盐浓度的升高而增 加，这称为盐溶现象。
在盐浓度达到某一界 限后，酶的溶解度随 盐浓度升高而降低， 这称为盐析现象。
3.3 酶的提取
❖影响因素
主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的溶 解度
酶向溶剂相中扩散速度 另外：温度-适当提高温度
改变条件、添加物质
分离
降低酶的溶解度
酶、杂质
❖机理
3.4.1 沉淀分离
沉淀分离方法
分离原理
盐析沉淀法
不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性， 通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从 溶液中析出沉淀
等电点沉淀法 两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性
电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH 值，使酶或杂质沉淀析出
3.3 酶的提取
❖方法
提取方法
使用的溶剂或溶液
提取对象
盐溶液提取 0.02～0.5mol/L
盐溶液
酸溶液提取 pH2～6
水溶液
碱溶液提取 pH8～12
水溶液
有机溶剂提取 与水混溶的有机
溶剂
提取在低浓度盐溶液中溶 解度较大的酶
提取在稀酸溶液中溶解度 大，且稳定性较好的酶
提取在稀碱溶液中溶解度 大且稳定性较好的酶
Chapter 3 The Extraction, Separation and
Purification of Enzyme
酶的提取与分离纯化
补充：发酵液的预处理 ——固液分离
（1）菌种 （2）培养基 （3）无机离子的去除 （4）杂蛋白质的去除 （5）色素及其他物质的去除
主要方法是离心分离和过滤
Contents of chapter 3
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
+
+
+
+
革兰氏阳性球菌 +
-
+
+
菌丝
-Fra Baidu bibliotek
++ - ++
孢子
-
-
-
-
3.3 酶的提取
❖定义
指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处 理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过 程。
❖目标
将目的酶最大限度地溶解出来 保持生物活性
❖原则
根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
pH值-避开酶的等电点 提取液体积-为原料体积的3～5倍， 分几次提取
适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂
3.4 酶的分离方法
3.4.1 沉淀分离 3.4.2 离心分离 3.4.3 过滤与膜分离 3.4.4 层析分离 3.4.5 电泳分离 3.4.6 萃取分离
3.4.1 沉淀分离
❖定义
是通过改变某些条件或添加某种物质， 使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出， 与其它溶质分离的技术过程。
物
菌
细菌
菌
酵母菌
霉菌
壁厚/ nm
15 ~ 50
10 ~ 13 同G+
100 ~ 300
100 ~ 250
层次
单层
多层
多层
多层
主要 组成
肽聚糖
(40% ~ 90%) 多糖
胞壁酸 蛋白质 脂多糖 (1%〜2%)
肽聚糖
(5% ~ 10%) 脂蛋白 脂多糖
(11% ~ 22%) 磷脂
蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 甘露聚糖(30%) 几丁质(1% ~ 2%) 蛋白质(6% ~ 8%)
有机溶剂沉淀法 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加
一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，
复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀
下来
选择性变性沉 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，
淀法
而不影响所需的酶
3.4.1 沉淀分离
❖盐析沉淀法
盐浓度（中性盐） 离子强度
3.2 细胞破碎
许多酶存在于细胞内。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高 压
为了提取这些胞内酶，
细 胞
首先需要对细胞进行
破
破碎处理。
碎 机
(1)机械破碎
(2)物理破碎
细胞
破
(3)化学破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
碎 珠
(4)酶解破碎
❖各种微生物细胞壁的结构与组成
微生 革兰氏阳性细 革兰氏阴性 放线
Ks分段盐析、β分段盐析
饱和度 温度-室温 pH-欲分离酶的等电点
3.4.1 沉淀分离
❖等电点沉淀法
等电点沉淀法往往与其它方法一起使用。
在加酸或加碱调节pH值的过程中， 要一 边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱 而引起的酶变性失活。
3.4.1 沉淀分离
❖有机溶剂沉淀法
有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲 醇 用量一般为酶液体积的2倍左右 分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将酶 液的pH值调节到欲分离酶的等电点附近。
1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取(重点) 4、酶的分离方法(重点) 5、酶的组合分离纯化策略 6、酶的浓缩、干燥与结晶
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎
动物、植物或微生物细胞
酶提取 发酵液
酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分离， 层析分离，电泳分离，萃取分离， 结晶分离等。
❖依据
要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
1、离心机
❖常速离心机（低速离心机）
最大转速8000 r/min，相对离心力（RCF）1×104 g 以下 用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离，酶的 结晶等较大颗粒的分离。
通过各种化学试剂对细胞膜的作 用，而使细胞破碎
有机溶剂： 表面活性剂
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用，使细胞外层结构 受到破坏，而达到细胞破碎
自溶法 外加酶制剂法
❖细胞对破碎方法的敏感性
细胞
声波 机械 渗透压 温度差
动植物
+++ +++ +++ +++
革兰氏阴性菌
++ ++ ++ ++
脂类(8.5% ~ 13.5%)
多聚糖
(80% ~ 90%) 脂类
蛋白质
❖细胞破碎方法及其原理
机械破碎 物理破碎
通过机械运动产生的剪切力，使 组织、细胞破碎。
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
化学破碎
3.4.1 沉淀分离
❖复合沉淀法
常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、 聚丙烯酸等高分子聚合物。
❖选择性变性沉淀法
加热、改变pH值、加进某些金属离子， 使杂蛋白变性沉淀除去。
对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂 质的种类，含量及其物化性质有比较全面 的了解。
3.4.2 离心分离
❖定义
是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不 同大小、不同密度的物质分离的技术过程。