免疫试验

实验七淋巴细胞增殖试验

一、目的要求：

1. 掌握淋巴增殖试验的原理与用途；

2. 熟悉淋巴细胞增殖试验常用的技术方法。

二、实验原理：

1.淋巴细胞增殖试验又称淋巴细胞转化试验（Lymphocyte proliferation / transformation test）,是指淋巴细胞在体外培养时，受到特异性抗原或非特异性促有丝分裂原如植物血凝素（PHA）或刀豆蛋白A (ConA)刺激后，可出现蛋白质及核酸合成增加，细胞体积增大，胞质增加，出现空泡，核仁明显，染色质疏松，并能进行分裂的淋巴母细胞，此称为淋巴细胞增殖或淋巴细胞转化，其增殖能力或转化率的高低，可以反映机体的细胞免疫水平。

淋巴细胞增殖试验常用的方法有形态学方法、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法，MTT 比色以及荧光染料流式细胞仪计数法等，可根据不同的试验条件及试验目的，选择不同的试验方法。

2.本试验目的是形态学方法，观察小鼠血液中的T淋巴细胞在体外培养过程中，当加入促有丝分裂原ConA(刀豆蛋白A)刺激后，可转化为体积较大的淋巴母细胞，胞浆增多而深染，核增大并可见核仁，把细胞制成涂片，在显微镜下可观察到细胞转化的典型形态。

为什么只考虑T淋巴细胞而不考虑B淋巴细胞？

因为：促有丝分裂原小鼠T细胞小鼠B细胞

ConA / PHA + _

也就是说，ConA / PHA能刺激T细胞增殖，而不能刺激B细胞，而其他细胞如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡成碎片。

三、应用：该实验是细胞免疫学功能检测的一项基本技术，即可在临床上作为测定机体细胞免疫功能的指标之一，也可用于免疫药理学的研究，T细胞功能检测（新药开发，疫苗研制）。

四、实验材料

1.动物：清洁级小鼠20只/班；

2.试剂：肝素抗凝剂，RPMI-1640完全细胞培养基，NH4cl (8.5g/L),甲醇，吉姆萨-瑞士染

液，ConA；

3.耗材：无菌青霉素小瓶，离心管，吸管，载玻片；

4.仪器：离心机，水浴锅，CO2培养箱，显微镜。

五、试验方法：

1.先向无菌的1.5ml离心管中加入肝素抗凝剂50μl；

2.取清洁级小鼠，75%酒精消毒（吸水纸吸干），在无菌操作台中用酒精棉球将小鼠眼球周

围消毒，无菌条件下摘取眼球采血，滴入盛有抗凝剂的离心管中；

3.去无菌肝素抗凝血0.3ml加入盛有2.7ml RPMI-1640培养液的无菌青霉素小瓶中，同时

加入ConA(5μg/ml)0.05ml,对照组不加ConA;

4.将细胞置37℃,5%CO2培养箱中培养3天，每天摇动1次；

5.培养结束后，将培养物摇匀并移入离心管中，1500r/min×10min;

6.弃上清，用4ml氯化铵液在室温下溶解红血球，约10min, 1700r/min×10min,弃上清；

7.取沉淀细胞推片，火焰固定，滴数滴瑞氏-吉姆萨染液入玻片盖满标本，4min，再加入

2-3滴PBS倍染1-3 min，倾去染液，蒸馏水洗，上油镜观察。

六、油镜观察结果：

转化的淋巴细胞体积增大，直径约20-30μm,形态不整齐，常有小突起，核变大，有核

仁1-2个，胞浆增多，常出现胞浆空泡。未转化的淋巴细胞直径一般为6-8μm，核染色致密，一般无核仁。油镜下计数200个淋巴细胞，按下式计算转化率。

淋巴细胞转化率=（转化的淋巴细胞数÷200）×100%

七、注意事项：实验中须严格无菌操作，防止污染。

实验八酶联免疫吸附试验

（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）

一、目的要求

1.熟悉酶联免疫吸附试验的原理及用途；

2.掌握生物素-亲和素系统ELISA法的原理和操作方法。

二、原理

酶联免疫吸附试验（ELISA）是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术。

生物素-亲和素系统ELISA（BA-ELISA）法是结合生物素（Biotin）与亲和素（Avidin）间的高度放大作用，建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，可以和生物素分子亲密结合；生物素很易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合。

首先将抗原（或抗体）结合到聚苯乙烯微量反映板孔中并保持其免疫活性；然后加入待检标本（测定其中的抗体或抗原），使其与聚苯乙烯微量反映板孔中的抗原或抗体起反应；再加入生物素和辣根过氧化物酶标记的亲和素。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特技性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。

三、应用：ELISA法可以检测体液中微量的特异性抗体或抗原，故广泛用于动物传染病的诊断、兽医药理学试验、食品卫生检验和各种细胞蛋白质的定量检测。

四、材料：

1.试剂：动物干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒1个/班；

2.仪器：酶标仪，移液器；

3.耗材：枪头，酶标板。

五、操作步骤（用于检测未知抗原的BA-ELISA）：

1.包被抗体：

（1）配制包被缓冲液：取出包被缓冲液原液，用去离子水将其10倍稀释（0.4ml:3.6ml）；（2）稀释抗体（Capture Ab）:用包被缓冲液稀释抗体（4μl:4ml）；

（3）在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加100μl，用封板膜封板，放入湿盒中4℃过夜（18-24h）；

2.洗板：次日，弃取孔内溶液，用洗涤缓冲液（每孔200μl）洗1次，每次2min；

3.封闭：

（1）配液（Assay diluent）:用去离子水5倍稀释Assay diluent: