共振光散射技术原理及其定量基础

共振光散射技术原理及其定量基础光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，是指当光通过介质时在入射光方向以外的各个方向上所观察到的光现象。它源于光电磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。根据电磁理论，振动着的偶极振子是一个二次波源，它向各个方向发射的电磁波就是散射波。光散射与介质的不均匀性有关，除了真空之外的其它所有介质都有一定程度的不均匀性，从而产生散射光。光散射技术在物理化学、胶体化学和高分子化学研究中具有十分重要的地位，主要用于大分子的结构及分子量测定[l,2]，以及提供有关粒子大小、形状等方面的信息，但在以前的分析化学领域中，特别是荧光测定中则成为一种干扰源而严重影响荧光分析的灵敏度，需采取措施加以避免和消除。

当介质中粒子直径远大于入射光波长(λ0)时，产生的散射可看成是反射和折射：如果介质中粒子直径与入射光波长相近，便产生了丁达尔(Tyndall)散射;如果介质中粒子很小，如d≤20λ0时，便产生以瑞利(Rayreigh)散射为主的分子散射。根据入射光和散射光波长的不同，光散射又可分为弹性散射、非弹性散射和准弹性散射。Rayreigh散射、浑浊介质Tyndall散射和透明介质的分子散射都是弹性散射;Raman散射和Bri1louin散射是非弹性散射;入射光频率和发射光频率仅有微小差别的是准弹性散射。

在假设没有吸收的波长范围内，瑞利散射光遵守I∝λ-4的瑞利定律。瑞利散射能为化学研究提供诸如分子形状和尺寸[3]、分子量[4]、旋转半径[5]以及反应过程的动态行为[6,7]等，但信号响应低和选择性差的缺点限制了瑞利散射技术在研究极稀溶液和复杂混合物中物质的浓度和结构信息方面的应用。但实际上所有的吸收过程都与光散射紧密相连，当瑞利散射位于或接近于分子吸收带时，电

子吸收电磁波频率与散射频率相同，电子因共振而强烈吸收光的能量并产生再次散射，这种吸收一再散射过程称为共振瑞利散射或共振增强瑞利散射(Resonance Rayleigh scattering，RRs)[8,9]，现在较普遍的称之为共振光散射(Resonance light scattering，RLS)。由于共振瑞利散射有极高的强度，所以使用普通的荧光分光光度计也能检测到，而不必使用昂贵的激光光源作为入射光。1993年美国著名化学家Pasternack等[l0]首次在普通的荧光分光光度计上用共振光散射技术研究了卟啉类化合物在核酸分子上的J型堆积，显示出该技术在研究生物大分子的识别、组装、超分子排列等方面独特的优势[l1-14]，激起了分析工作者的浓厚兴趣和广泛关注，得到了迅速发展，从而为共振瑞利散射技术的深入研究和广泛应用奠定了基础。

共振光散射理论及其根据宏观波动理论，分子散射源于折光指数(m)的涨落，而折光指数可以分为实部和虚部两部分，即，m=n-ik，其中n是溶液的折光指数，k是吸光系数，在分子吸收带附近溶液的折光指数与波长和摩尔吸光系数的关系与分子在整个波长范围的吸收有关，可用Kronig-Kramers方程[15]表示:

(l)

式中n0为纯溶剂的折光指数，c是溶液的物质的量浓度，λ0是真空中入射光和散射光波长，入是整个分子吸收带中的任意研究波长，ε(λ)为所研究波长处分子的摩尔吸光系数。与n不同的是，构成折光指数(m)的吸光系数(k)仅与吸收带相关的分子量子跃迁有关，它与入。处的摩尔吸光系数ε(λ)的关系为[l5]:

(2)

这样就得到表征体系光散射特征的瑞利比(Rayreigh ratio)，在与入射光成90º角处检测，瑞利比大小为[15]:

(3)

式中N A是Avogadro常数，%肠。和。k俗。分别是1.0M溶液中表示折光指数实部和虚部的增量，q，是表示光散射增加的Cabannes因子。引人n和k，可得

(4)

因此，如果人射光波长接近分子吸收带，则饥/。。共O，即除折光指数的实部对光散射有贡献外，虚部也具有相当大的贡献，特别是吸收带强烈时贡献更大，将产生共振Rayleigh

光散射增强，增强与分子吸收带中电子跃迁有关。

由于R=IRL班。，其中IRLs表示共振光散射强度，I。表示入射光强度，则:

(5)

由此式可知，在其它条件一定时，共振瑞利散射强度与溶液的物质的量浓度(C)成正比，

这是共振光散射作为物质浓度测定方法的定量基础。

由于共振光散射信号属于同步发光，所以可以根据同步发光方程理解其定量基础[16]:

IsL=KebEex久x)Eem(从x+乙劝(6)

或

IsL=KebEe、(凡m一乙劝Eem(从m) (7)

其中，Eex一给定激发波长处(从厂从m一乙劝激发函数，Eem一对应发射光波长处(从笼二从m一刁劝

发射函数(从=m从x+乙劝，K一与仪器条件常数有关的常数，b一液池厚度，c 一溶质的物质的

量浓度。当乙入=Onlll时，即得共振光散射强度:

I璐L=KebEex(从x)Eem(从x) (8)

或

IRsL=KebEex(凡m)Eem(从m)(9)

即在条件一定时，共振光散射强度与散射粒子得浓度成正比。据此可用于散射粒子的定量测定。

3蛋白质的测定

蛋白质的测定方法很多，如最早的浊度法、凯氏定氮法，和目前应用最广、操作较为简便的吸光光度法、荧光光度法，还有后来发展起来的高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。

3.1 浊度法

利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度相比而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法[l6]。该法操作简便、快速、试剂易购，为临床常规检查所用，但是由于所用试剂的浓度、滤光片的波氏及反应浓度没有标准化，因此结果的准确度和精密度较差。

3.2 凯氏定氮法(Kjeldahl)

该法是利用一般蛋白质含氮量平均在16%，可将测得的含氮量折算成样品中蛋白质的含量[l7]。凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高。