第九章 人工合成酵母基因组(一)

– 合成生物学：“细胞工厂”“底盘细胞”
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 酿酒酵母是1996年完成全基因组测序，第一个完 成基因组测序的真核生物。 • 酿酒酵母的基因组包含大约1200万碱基对，分成 16组染色体，共有6275个基因，其中可能约有 5800个已知功能基因。
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换位
替换
TAG stop codons replaced by TAA
引入
不变
Gene order
Individual tRNA genes synonymous codons LoxP Sym sites PCRTags
Noncoding regions
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§4.1 人工改造基础
– URA3基因 系统名：YEL021W
Yeast 第V号染色体上 左臂
标准名：URA3（URAcil requiring）
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§3 酵母基因命名法
• 酿酒酵母基因/蛋白质书写原则
– 基因名 需要斜体
• 细胞中存在该基因：大写斜体 URA3 • 细胞中该基因缺失：小写斜体 ura3 或 ura3△ • 细胞中该基因突变：小写斜体带编号 ura3-1
– 蛋白名称为正体
• 大写正体：URA3 • 首字母大写，后两位小写：Ura3 • 首字母大写，后两位小写，最后加p：Ura3p BAG-TJU
§3 酵母基因命名法
• 酿酒酵母基因/蛋白质书写原则
– 实验室常用酵母野生型菌株
• BY4741： MATa; his3△; leu2△; met15△; ura3△ • BY4742： MATα; his3△; leu2△; lys2△; ura3△ • BY4743： MATa/α; his3△/his3△; leu2△ /leu2△; lys2△ /LYS2; MET15/met15△; ura3△ /ura3△ • W303a： MATa; leu2-3112; trp1-1; can1-100; ura3-1; ade2-1; his3-11,15
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§3 酵母基因命名法
• 不同物种基因/蛋白命名法并不相同
– 大肠杆菌：hisG – 人类：p38 – 酵母：URA3
• 酿酒酵母基因名称
– 系统名：基因在染色体上的位置 – 标准名(Standard Name)：基因功能描述
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§3 酵母基因命名法
• 酿酒酵母基因命名原则
Байду номын сангаас
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§4.4 引入新序列
• Cre-LoxP重组酶系统
– Cre重组酶
• 于1981年从P1噬菌体中发现，基因编码区序列全长 1029bp。 • 一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序 列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列 被删除或重组。
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§4.4 引入新序列
• 5’ C1－3A • 3’ G1－3T
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 复制起点
– 酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一 小段DNA序列，通常称为自主复制序列（ARS， autonomously replicating sequence ）。 – 自1979年首次发现酿酒酵母的ARS以来，已在酿酒酵 母中发现约有400个ARS，但这些ARS使用频率不同， 差异十分巨大。
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§4.4 引入新序列
• 必需基因(essential gene) ：
– 一些基因在突变时会引起致死表型，这些基因 被称为必需基因。
张春霆 院士
生物信息学家 天大理学院 建立了酵母必需基因库
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§4.4 引入新序列
• 非必需基因：
– 非必需基因 ≠ 可以随意缺失的基因 – 同时缺多个非必需基因也有可能致死 – 能减到多小？
Isaacs, F. J. et al. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genomewide codon replacement. Science 333, 348–353 (2011).
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§4.3 替换
• PCRTags
• 酵母是一类单细胞的真核生物。
– 它有完整的亚细胞结构和控制严密的基因表达 调控机制。 – 它既能通过有丝分裂进行无性繁殖 – 也可以通过减数分裂实现有性繁殖。
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§1 酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– – – – – – – – 域：真核域 界：真菌界 门：子囊菌门 纲：半子囊菌纲 目：酵母目 科：酵母科 属：酵母属 种：酿酒酵母
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 自主复制序列ARS的结构
– 酿酒酵母中，ARS是长度为100-200bp、富含AT的DNA 片段。 – 根据其在质粒中的稳定性，可将ARS分为A、B、C三个 结构域，其中A和B最为重要。
• A区：由11bp核苷酸（A/T）TTTAT(A/G)TTT(A/T）组成的保守 序列，即ARS共有序列。 • B区：位于ARS的3'末端，长度约80bp。 • C区：结构域位于ARS的5'末端，这一结构域也是富含AT，但 C结构域之间不具有同源性，也不含共有序列。
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– 有性繁殖：子囊孢子
• 单倍体可以交配，重新形成二倍体 • 酵母有两种交配类型，称作a和α
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§1 酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
酵母细胞生活史
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§1 酿酒酵母简介
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§1 酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– 芽殖(Budding)：正常繁殖方式
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§1 酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– 芽殖(Budding)：正常繁殖方式
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§1 酿酒酵母简介
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§1 酿酒酵母简介
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
– 又称面包酵母或者出芽酵母。 – 在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物。
• Morganism
– 发酵中最常用的生物种类。 – 细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。 – 同时存在单倍体和双倍体(酵母的优势形态)。
• “最小基因组” • “精简基因组” • “精简基因集”
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§4.4 引入新序列
• 在每个非必需基因前后加入了特殊序列
– LoxP Sym sites
• Cre-LoxP重组酶系统
– 特异性删除某特定序列的技术
– 在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基 因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打 靶策略的技术核心。
酿酒酵母基因功能标注：SC1.0计划
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§4 人工设计基因组原则
§ 4.1 人工改造原理 § 4.2 删除与移位 § 4.3 替换 § 4.4 引入新序列
§ 4.5 SCRaMbLE !
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§4.1 人工设计基因组原则
• 利用密码子简并性实现
Elements
删除
Retrotransposons Subtelomeric repeats(Y’&X’) Introns
李炳志 bzli@tju.edu.cn 2013-04
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第九章 人工合成酵母基因组
§ 1 酿酒酵母简介 § 2 酿酒酵母基因组结构特点 § 3 酵母基因命名法
§ 4 人工设计基因组的原则
§ 5 人工合成基因组的技术
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§1 酿酒酵母简介
• 酵母（Yeast）是一类种类繁多的生物资源， 已知有80个属约600多种，数千个分离株。
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§4.3 替换
• 基本理念：
– 将酵母基因组打造得更便于今后人工操作
• 终止密码子替换
• PCRTags • 部分同义密码子替换
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§4.3 替换
• 终止密码子替换
– 将TAG替换为TAA
• 在正常情况下这两者均将转录为终止密码子
– 有研究小组构建了一种新型tRNA
• 当细胞中表达该新型tRNA的基因 • TAA将不再作为终止密码子 • 翻译将继续下去
• 着丝粒种类
– 短着丝粒（点着丝粒）：约200bp
• 酵母
– 区域着丝粒：序列较长（从40kb至几Mb），含有很多 重复序列
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 酵母着丝粒
在酿酒酵母中，所有 染色体的CEN序列的长度 均大于130bp，由5’→3’依 次分为CDE-I、CDE-II和 CDE-III。
§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 酿酒酵母的单倍体细胞含16条染色体，总长度为12Mb， 其中第I条最短，第IV条最长。
• 基因组中没有明显的操纵子结构，有间隔区和内含子。
• 酿酒酵母染色体基因组中，ORF大约占整个基因组的70% 基因间平均间隔为600bp。 • 酿酒酵母中约4%编码蛋白质的基因含有内含子。
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§4.2 删除与移位
• 基本理念：
– 优化基因组，减少不稳定和冗余结构
• 删除
– 逆转录转座子 – 端粒重复部分 – 内含子
• 移位
– tRNA基因
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§4.2 删除与移位
• 删除
– 逆转录转座子
• 目前推测这类重复序列并非必需部分 • 还会引起染色体不稳定
– 亚端粒重复部分(Subtelomeric repeats)
人工基因组的设计与合成
李炳志 bzli@tju.edu.cn 2013-04
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Synthetic Yeast 2.0
• Building the world‘s first synthetic eukaryotic genome together！
Dr. Jef Boeke
第九章 人工合成酵母基因组
• Cre-LoxP重组酶系统
– LoxP（locus of X-over P1）序列：
• 来源于P1噬菌体 • 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同 组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。 • 13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
• 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae）
– 最符合基因表达的宿主，因此被最早成为基因 表达系统的宿主。 – 已广泛被用来表达各种各样的外源基因。
• 用酿酒酵母表达的乙型肝炎疫苗（Merck公司），人 胰岛素（Novo-Nordisk公司）和人粒细胞集落刺激因 子（Immunex公司）都已成为正式上市的基因工程 产品。
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 染色体结构
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 着丝粒centromere
– 染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域，由无 编码意义的高度重复DNA序列组成。 – 一般位于染色体的主缢痕或染色体端部，使姐妹染色 单体连在一起。
• 有两类，X’和Y’(无功能) • 引起端粒沉默或染色体分离 • Y’全部删除，X’用更优化的序列取代
– 内含子
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§4.2 删除与移位
• 移位
– tRNA基因 – 在基因组中高度冗余的一类基因
• 共计275个tRNA基因 • 仅有47种tRNA • 这些冗余基因会造成染色体不稳定
– 从各个染色体上剔除，专门放在一个新染 色体上
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§2 酿酒酵母基因组结构特点
• 端粒Telomere
– 真核细胞内线性染色体末端的一种特殊结构，由DNA简 单重复序列以及同这些序列专一性结合的蛋白质构成 – 在大多数生物中，端粒DNA只由几个碱基组成的DNA重 复单位通过串联重复而形成的，长度从20bp至几kb不 等。 – 酿酒酵母端粒DNA长约为300bp，其重复单位为
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§3 酵母基因命名法
• 酿酒酵母基因信息查询
– SGD： http://www.yeastgenome.org/
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§3 酵母基因命名法
• 如何确定酵母基因的ORF？
– 起始密码子：ATG – 终止密码子：UAG, UAA, UGA 酵母基因组的 ORF 平均长度为 1450bp 即 483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的 一个功能未知的ORF (4910个密码子)，还有极 少数的ORF长度超过1500个密码子。