第三章 发育生物学研究技术和方法PPT

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• (一)单色全胚原位杂交 • 1．原位杂交试剂 • 2．操作步骤 • (1)探针制备 • (2)胚胎的固定与保存 • (3)原位杂交 • (4)洗脱和检测
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(二)双色全胚荧光原位杂交
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• 全胚原位杂交的基本原理: • 是用各种标记物标记与体内特定mRNA互补
的RNA分子(反义RNA)，以它们作为探针与 动物的整体胚胎进行原位杂交，然后用相 应的抗体来检测特异探针的分布情况。以 下以爪蟾胚胎为例介绍全胚原位杂交的操 作步骤。其他动物的全胚原位杂交与爪蟾 基本相同。
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• 一．显微操作系统
• 显微操作系统已经历了多次更新和发展。现 今普遍使用的显微操作器一般由带荧光或相差的 倒置显微镜、显微操作臂、注射器及玻璃微吸 管、，摄像装置和计算机图像处理装置等组成。 为了配制一个性能优良的用于发育生物学研究的 显微操作系统，虽有许多必须考虑的因素，但由 于现在普遍采用的显微操作系统一般都是配套购 置，且都具有详细的说明书，因而这里就不详述。 有兴趣者还可参考有关文献。
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二．胚胎组织切片原位杂交
• 原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法。 虽然全胚原位杂交简单易行，但在许多情 况下，该方法还达不到研究的要求，因而 需要在胚胎的组织切片上进行杂交。在胚 胎的组织切片上杂交的有利因素在于不存 在探针不能渗入到胚胎内部的问题。
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第三节 胚胎免疫组织化学技术
• 一．用途：胚胎免疫组织化学是定位 胚胎内的内源或外源蛋白质的一种有 效方法。该技术操作相对简单，如果 和其他一些免疫学技术结合使用，可 以快速获得相关蛋白质功能的有关信 息。
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• 用2种不同的标记物(DIG-11-dUTP，生物 素一11一dUTP等)分别标记2个探针，同时 与胚胎杂交，然后对两个探针分别用相应 的抗体进行检测。
• 在双色全胚原位杂交中，探针的制备、胚 胎的固定杂交及洗脱方法与单色原位杂交 步骤相同，只是检测方法有所不同。两次 加入不同的抗体进行两次显色。
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• 二、显微注射步骤
• 1．注射用卵母细胞的制备
• 在鱼类和两栖类动物中，卵母细胞可采用两种方 法获得，一是将动物麻醉后，通过解剖取出卵巢 叶(两栖动物)，或用挖卵器从泄殖孔取出所需要 的卵母细胞；另一种方法是杀死动物，取出全部 卵巢。对哺乳动物而言，一般通过超数排卵 (superovulation)获得更多的卵母细胞，即模拟 体内卵母细胞发育与排放的激素调节模式，通过 注射不同的促性腺激素，刺激暂时处于休眠状态 的卵母细胞进入成熟发育期，成熟后排放到输卵 管中。由此可以获得的卵母细胞远多于自然排卵。 下面以两栖动物爪蟾为例，简要介绍制备卵母细 胞的这两种方法的基本步骤。
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第三章 发育生物学研究技术 和方法
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• 在第一章回顾发育生物学的历史时，我们已了解 了实验技术对发育生物学发展的突出贡献，特别 是分子生物学的兴起给发育生物学的发展所带来 的活力。事实上，发育生物学是一门实验性很强 的学科，很多重要的发育理论和发育模型都是在 大量实验结果的基础上建立起来的。其中涉及各 种各样的研究技术和方法，既有传统的胚胎学和 细胞学方法，如胚胎移植、胚胎分割、细胞核移 植等，又有新发展的分子生物学方法，如显微注 射、原位杂交,基因转移及基因功能分析等。本章 将重点介绍发育生物学研究中的几种常用方法 ‘
• 二．胚胎免疫组织化学技术的基本原理：
• 是用某种蛋白质免疫其他动物(通常为鼠或 兔)而获得相应的抗体(初级抗体)，再用初 级抗体免疫另一种动物，获得次级抗体。 在次级抗体上偶联上一种酶(如碱性磷酸化 酶)，构成免疫复合物。将胚胎与初级抗体 结合后，洗去多余的抗体，再与免疫复合 物结合。最后利用显色反应来确定胚胎内 特定蛋白质的表达位置。本节以爪蟾胚胎 为例介绍胚胎蛋白质免疫组织化学检测的 操作方法。
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• 第一节 显微注射
• 显微注射(microinj ection)是发育生 物学研究中最经典而又使用最为普遍的一 种方法，特别是近十几年来通过基因转移 创造生物反应器这一具有明显商业价值的 应用研究的开展，更显现出这一技术的活 力。本节将介绍显微操作系统、注射用卵 子或胚胎的准备、操作过程等。
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第二节胚胎原位杂交
• 一．全胚原位杂交 • 全胚原位杂交(whole mount insuite
hybridization，WISH)是广泛用于胚胎发 育调控基因表达研究的一种技术。近年来 该技术发展较快，不仅可以检测到较弱的 杂交信号，而且可以多色杂交，检测多个 基因的表达情况。
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• (1)取出完整卵巢及卵母细胞的培养 • (2)取出卵巢叶及卵母细胞的培养 • 2．注射用胚胎的制备 • 3.显微注射 • 在开始注射之前，应准备好所有试剂和
器具。
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Байду номын сангаас
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• 三．操作方法 • 1．实验所需溶液 • 2．爪蟾胚胎免疫组织化学检测 • (1)胚胎固定 • (2)漂白 • (3)免疫检测 • (4)胚胎切片
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