实验八 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

生物化学与分子生物学实验
实验步骤
凝胶的处理
G-25颗粒(5g) 25颗粒(5g) 颗粒 蒸馏水室温溶胀 去除杂质 10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜) 10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜) 倍体积的蒸馏水浸泡
生物化学与分子生物学实验
装柱
层析管洗净、 层析管洗净、排出管中气泡
关闭出口
固定在铁架上 加入缓冲液没过砂芯
生物化学与分子生物学实验
实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题
生物化学与分子生物学实验
预 习
实验九 酶法测血清葡萄糖
生物化学与分子生物学实验
钼酸铵 + 氨基萘酚磺酸 + 磷酸盐 15%三氯醋酸+蛋白质 三氯醋酸
钼蓝（蓝色） 钼蓝（蓝色）
变性、 变性、沉淀
生物化学与分子生物学实验
实验器材与试剂
层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器 血红蛋白溶液 交联葡聚糖G-25 交联葡聚糖 0.4% K3Fe(CN)6 氨基萘酚磺酸试剂 钼酸铵试剂 15%三氯醋酸 三氯醋酸 0.1M磷酸缓冲液 磷酸缓冲液
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交联葡聚糖
高铁血红蛋 白与高铁氰 化钾混合物 化钾混合物
高铁血红蛋白
高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
透 析 法：
利wenku.baidu.com特制的半透膜把大小分子分开 的方法， 的方法，截止分子量一般为一万
透析袋 浓缩的蛋白 混合样品 透析液
临床应用： 临床应用： 血液透析
开始透析 处于平衡状态
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透析
将MetHb 洗脱液装 入透析袋
将透析袋 口用止水 夹密封
将透析袋悬 入装有蒸馏 水的烧杯中
打开磁力搅 拌器， 拌器，透析 30分钟 分钟
生物化学与分子生物学实验
鉴定 磷酸盐的鉴定
试剂量 钼酸铵试 剂 透析前杯 内蒸馏水 透析后杯 内蒸馏水 15滴 15滴 10滴 10滴 2滴 2滴 氨基萘酚磺 酸试剂 3滴 3滴 反应结 果 ？ ？
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的鉴定
透析前杯内蒸 馏水 透析后杯内蒸 馏水 透析袋内溶液 试液量 40滴 滴 40滴 滴 10滴 滴 15%三氯醋酸 15%三氯醋酸 反应结果 20滴 滴 ？ 20滴 滴 5滴 滴 ？ ？
生物化学与分子生物学实验
注意事项
装柱后检查凝胶是否均匀， 装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡 或分层时， 或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者 重新装柱，保持柱床面平整； 重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满， 透析袋中的液体不可装满，否则会将 透析袋胀破。 透析袋胀破。
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实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白 与高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
实验目的
了解凝胶层析的原理及应用 通过血红蛋白脱盐实验， 通过血红蛋白脱盐实验，初步掌 握凝胶层析技术
生物化学与分子生物学实验
实验原理
凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作 用，根据被分离物质的分子大小不同来进 根据被分离物质的分子大小不同来进 分子大小不同 行分离，也称分子筛层析、排阻层析 行分离，也称分子筛层析、
生物化学与分子生物学实验
思考题
向凝胶柱中加入样品时， 向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶 面平整？上样体积为什么不能太大？ 面平整？上样体积为什么不能太大？ 请解释为什么在洗脱样品时， 请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快 或太慢？ 或太慢？ 圆盘电泳的分子筛效应和凝胶过滤的分子筛 效应原理上有何不同？ 效应原理上有何不同？
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加样
放掉多余缓冲液至刚露出床面 准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液 准备血红蛋白(3滴 (8滴 (3
自距床面1mm高处靠壁缓慢、 自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入 1mm高处靠壁缓慢
打开出口
至液面降至与凝胶面相平
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洗脱与收集
生物化学与分子生物学实验
单个凝胶珠本身象“筛子” 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型 凝胶的筛孔的大小不同。 凝胶的筛孔的大小不同。
交联葡聚糖的凝胶颗粒
生物化学与分子生物学实验
分子筛效应： 分子筛效应：
大分子在前， 大分子在前，小分子在后
生物化学与分子生物学实验
Hb ﹢ K3Fe(CN)6
Mw=64500)， 完全排阻 Mw=64500)，
生物化学与分子生物学实验
实验结果
磷酸盐的鉴定
试剂量 透析前杯内 蒸馏水 透析后杯内 蒸馏水
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸试剂
反应结果
15滴 滴 10滴 滴
2滴 滴 2滴 滴
3滴 滴 3滴 滴
无 蓝色
生物化学与分子生物学实验
蛋白质的鉴定
试液量 透析前杯内蒸馏水 透析后杯内蒸馏水 透析袋内溶液 40滴 滴 40滴 滴 10滴 滴
生物化学与分子生物学实验
K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直 的相对分子质量较小， 径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶 颗粒的网孔， 颗粒的网孔，在向下移动过程中流程 较长，移动速度慢， 较长，移动速度慢，最后流出
生物化学与分子生物学实验
磷酸盐是小分子， 磷酸盐是小分子，小于透析袋孔 是小分子 径的小，能够穿过透析袋； 径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质 是大分子，不能透过透析袋， 是大分子，不能透过透析袋，只能保 留在袋中
15%三氯醋酸 15%三氯醋酸 20滴 滴 20滴 滴 5滴 滴
反应结果
无 无
有沉淀
生物化学与分子生物学实验
MetHb的相对分子量较大， MetHb的相对分子量较大，直径大于 的相对分子量较大 凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在 凝胶网孔被完全排阻在孔外， 被完全排阻在孔外 凝胶颗粒外的空间向下流动， 凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较 短，移动速度快，首先流出 移动速度快，
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm以上 自然沉降至柱床高度达20cm以上 20cm 不可露出创面 盖滤纸
生物化学与分子生物学实验
装柱要求: 装柱要求
连续 均匀 无气泡 无分层 床面平整
生物化学与分子生物学实验
平衡
层析柱稳定后接储液瓶， 层析柱稳定后接储液瓶，打开 出口，用两倍于床体积的缓冲液洗 出口， 脱平衡(5-10min )，不可露出床面， 脱平衡 ，不可露出床面， 关闭出口
缓慢加入样品量体积的洗脱液 不冲破胶面） （不冲破胶面）
打开出口
至洗脱液刚好流入床面
关闭出口
再加洗脱液至3 4cm高 再加洗脱液至3-4cm高 调节活塞（ /5秒 连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱 收集红褐色的MetHb色带 收集红褐色的MetHb色带 MetHb
生物化学与分子生物学实验
带网孔的 葡聚糖珠 小分子进入 葡聚糖珠内 大分子不能 进入珠内， 进入珠内， 经珠之间缝 隙流出
凝胶过滤层析过程示意图
生物化学与分子生物学实验
洗脱与收集
将黄色的K 色带完全洗脱后， 将黄色的 3Fe(CN)6色带完全洗脱后， 用2~3倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶 倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶 用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中 的凝胶吹至小烧杯中回收 的凝胶吹至小烧杯中回收
MetHb
高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色， 高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色， 分子量大(MetHb
高铁氰化钾分子量小(K 黄色， 高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色， 分子量小 可完全进入凝胶颗粒网孔内， Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内， 从而达到分离的目的