胚胎冷冻保存

将胚胎在含20%小妞血清的PBS溶液中清洗两次 将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油 和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10min 将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS 溶液中，立即转入胚胎冷冻细管 将细管在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存 解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速 投入20℃温水中，摇动细胞管使其解冻均匀 将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的 PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小 牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植




将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次 讲洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油和20%小 牛血清的PBS的冷冻中平衡20min 将胚胎和冷冻液装入0.25ml胚胎冷冻细管中，封口，并在细 管外标记供体号、胚胎数量、等级、冷冻日期等 将装入胚胎的习惯放入冷冻仪中，在0℃平衡10min，以 1℃|min的速度降至-7~-6℃，并在此温度下诱发洁净，平衡 10min，然后0.3℃的速度降温至-38~-35℃，投入液氮保存 解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10s， 立即至于37℃水浴解冻，1min后取出完成解冻过程 将细管中的冷冻液及胚胎推出，在现实镜下找到胚胎并移入 解冻液。采用三步法脱除甘油，每步5~7min。最后用PBS 液将胚胎洗3~5遍，供移植备用。
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二. 20 06年2月一20 07年12月在我中心进行冷冻胚胎移植患者112例，年龄 23~39岁，平均(30 88士3 72)岁。不孕年限1~17年，平均(4 79士3 24)年。其中 85例患者年龄< 35岁，27例患者年龄大于等于35岁。84例采用白然周期准备了 宫内膜，28例采用激素替代周期准备了宫内膜。 胚胎冷冻及解冻:选择胚胎移植后(取卵后第3天)剩余的优质胚胎或因卵巢过度刺 激综合征等原因未能移植的优质胚胎进行冷冻。采用慢速冷冻一快速解冻的方法 进行胚胎冷冻及解冻。 冷冻方法:冷冻保护剂为丙二醇和蔗糖。室温下，将胚胎移至含1.5 mol/L的 丙二醇和12 mg/mL人血清白蛋白的H TF-H epes( In V itro C are 美国)溶液中平 衡10 m in接着移至含1.5 m ol/L丙二醇,O.1mol/L蔗糖和12 mg/mL人血清白蛋白 的HTF-H epos溶液30 s后吸入麦管，每管装1一3个胚胎，将麦管放入Kyro lOMRV, UK型程序冷冻仪(Plan-er、英国)，以2℃/min的速率从37℃降温至一7℃ 植冰，以0.3℃/m in的速率降温至一3 0℃，再以10℃/min降至一120℃，取出麦 管浸入液氮罐保存。 解冻方法:从液氮中取出标记冷冻麦管1个，在空气中停留30s放入30℃水中 平衡30、将麦管内的胚胎移至含0.5 mol/L蔗糖和12 mg /mL人血清白蛋白的 HTF-H epes溶液中5min 移至含0.2m ol/L蔗糖和12 mg/mL人血清白蛋白的H TFH ep es溶液中5 m in,移至含12 mg/mL人血清白蛋白的HTF-Hepes。溶液中平衡 10 m in,逐步升温至37℃，最后将胚胎移入37℃、5% COz培养箱内培养。解冻 后胚胎卵裂球存活率>50%为存活胚胎。
三. 1.研究对象 1999年12月一2001年12月在本生殖医学中心，应用卵细胞内单精 子显微注射(ICSI)及常规体外受精(IVF)技术治疗不育不孕症的71个周期中，将胚 胎移植后剩余的优质胚胎进行冷冻保存。 2.治疗方法术前检查夫妇双方的染色体核型正常，血液促黄体生成素(LH)水平 在正常范围。患者妻子从月经黄体中期开始采用GnRH-a-FSH-HMG-hCG方案进 行超促排卵。采用常规NF和ICSI技术进行体外受精和胚胎移植。 3.胚胎冷冻采用慢速、逐步降沮的冷冻程序，以丙二醇、蔗糖为冷冻保护剂， 用CL一3000程序冷冻仪进行程序冷冻，然后将胚胎贮存于液氮中。冷冻程序:室 温以一1 }/min到一69C;浸润I mln，植冰，再保温9min;以一0. 39C/min到一3290; 一0. 29C/min到一369C;一19C/min到一759C结束。 4.胚胎解冻及移植胚胎复苏的方法采用快速解冻法。解冻液以PBS、丙二醉、 蔗糖为原料以适当的比例进行配制。在女方自然月经周期尿LH峰的第3天或第4 天将冷冻胚胎复苏，将复苏后胚胎在墙养箱中培养2一4b,选择有半数以上细胞成 活的胚胎进行移植。移植2周后进行妊振试验,4周后B超检查有无孕囊及胎心搏动。 5.结果 在71个胚胎冷冻贮存周期中，25个周期已经妊振。在另外46个周期 中，进行冷冻胚胎复苏后移植的有24个周期。一共冷冻贮存了122个4一8细胞胚 胎，解冻后共有88个胚胎成活(胚胎复苏后有半数以上胚胎细胞成活的胚胎可认 为是成活胚胎)，可用于移植。在24个周期中没有一个因复苏失败而放弃移植的， 复苏率为72. 1396。临床妊振7个周期，周期临床妊娠率为29. 17 %。已于2001 年2月和9月分别生下健康女婴和男婴各一个，目前婴儿生长发育正常，其他5例 胎儿发育良好。

胚胎冻存的损伤机制

胚胎的冷冻实际上是一个脱水过程，冷冻保存的关 键是设法减少细胞内冰晶对胚胎造成的损伤。正常 胚胎细胞内水分含量达80%以上，在冷冻过程中， 胚胎细胞中的水分将从细胞中游离出来冷冻成冰晶， 一方而对胚胎细胞造成机械性损伤即冰晶损伤，另 一方而导致未结冰的细胞内溶液渗透压急剧增高， 造成蛋自质变性即溶液损伤，二者最后都导致胚胎 小可逆性变化而死亡。
冷冻保存技术---胚胎 冷冻保存
胚胎冷冻保存是将胚胎保存在-196℃超低温的液氮 （或其他抗冻保护剂）中做长期保存。可使胚胎移植不 受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率，长期 保存优良基因的目的。胚胎冷冻技术为建立优良品种的 胚胎库提供了条件，还可以长期保存珍贵或濒临灭绝的 动物资源。 研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要 的意义。
抗冻保护剂 胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚 胎的损伤。对于胚胎的冷冻和解冻，一50~15℃是一个致死温度区。在这个温度区细胞 容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免 冰晶的形成。 分类：渗透型冷冻保护剂 非渗透性冷冻保护剂

渗透型冷冻保护剂



属于细胞内冷冻保护剂，一般小分子物质，在0℃ 以上很容易通过细胞膜进入细胞质。 机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞 内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂 与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度 从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。 常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜 （DMSO）、丙二醇和乙二醇等。
一步冷冻法 也叫一步细管法。 该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的 冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内 用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于 在生产中推广应用。

玻璃化冷冻法



将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后， 直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度 时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液 态变为透明的固态，形成玻璃化。 用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后 分步脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是 一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪 器。 是近年来发展起来的一种新的方法。 大致基本步骤如下：



冷冻保护液常用pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液（PBS） 来配制，也可用生理盐水或M199来配制。 现有保存方法有3种：程序冷冻法：一步冷冻法和 玻璃化冷冻化。 在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保 护剂；快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种抗冷冻保 护剂，如甘油、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二 醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。
人类胚胎冷冻案例

一. 研究对象:白2 000年1月至20 O 1年7月止，于本室进行IV F- E T治疗的患者 22例共行冷冻胚胎移植24个周期，年龄24 ~ 31岁，平均年龄(28士2. 96)岁，不 孕年限1~10年，平均不孕年限( 3. 5士2. 23)年。其中临床激素替代周期7个周期， 白然周期17个周期。 二、胚胎冷冻:22例患者按本室常规进行IVF一ET治疗。胚胎移植术后，从剩 余胚胎中选择优质胚胎分别放入含25%人血白蛋白的DPBS缓冲液5分钟、1. 5M PROH液10分钟、1. 5M PROH+0. 1M Sucrose液5分钟，然后迅速装管，总操 作时问不超过20分钟。最后将胚胎迅速放入程序冷冻仪( Cryo L一863，澳大利 亚)中进行程序冷冻，程序为:从22℃开始，以一2 0C/分钟的速度降至一6 0C,停 留5分钟，进行人工植冰，然后继续停留10分钟，再以一0. 3℃的速度降至一 37℃，以一0.6℃/分钟降至一40 ℃，然后将胚胎转移入液氮中。 22例患者共进行了24个周期的胚胎冻融移植，共获得临床妊娠5例，临床妊娠 率为22.7%
胚胎冷冻保存原理 胚胎冻存的损伤机制 抗冻保护剂 胚胎冷冻方法 人类胚胎冷冻案例
胚胎冷冻保存原理 冷冻保存,是将体外培养物悬浮在加有或小加 冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降 至零下某一温度，对其长期保存的过程。此 时细胞的代谢活动被完全抑制，使细胞的生 命在静比状态下保存来，从而达到长期保存 的目的。
程序冷冻法



也叫慢速冷冻法、逐步降温法。 所用冷冻保护剂一般为： 二甲亚砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、 1,2-丙二醇等。该法采用较低浓度的冷冻保护剂， 对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操 作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊 的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此 法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。 影响因素包括：抗冻保护剂的选择与浓度、植冰和 降温速度、解冻方法、抗冻的脱出等 大致基本步骤如下：
非渗透型冷冻保护剂 属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质， 能够溶解于水，但不能进入细胞。 机理：非渗透型冷冻保护剂主要通过该改变 渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作 用。 常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如 葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子 糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。

冷冻方法