酵母单杂交手册(translated by mony)

酵母单杂交手册

目录

1简介

2试剂盒包含的内容

3缩写

4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息

5附加材料&酵母培养基

A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料

B 相应的培养基要求

6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建

A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒

B方法：构建诱饵-受体酵母菌株

7利用AbA r的表达检测诱饵菌株

A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度

8 cDNA文库的构建

A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链

B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链

C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA

9单杂交的文库的构建和筛选

A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选

10结果分析

11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离

A方法：通过划板确认受体表型

B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒

D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆

E分析阳性克隆的序列

12问题排除指南

13参考文献

附录A：质粒信息

附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物

附录C：SMART技术原理

图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用

图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株

图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库

图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功

图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增

图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物

图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异

图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用

图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱

图11 pGADT7-Rec载体图谱

图12 pGADT7载体图谱

表格

表1 Y1HGold酵母菌株基因型

表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型

表3 AbA r本底表达的预期结果

表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系

表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南

表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分

表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容

A介绍

Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。Matchmaker Gold Systems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1）

图1. 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用

将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性(AbAr) 基因的表达。

酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli内构建的文库。Matchmaker Gold System方法中的文库构建用到了SMART cDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng 的RNA，即可使用该方法构建cDNA 文库。

B酵母单杂交的原理——蛋白-DNA互作的一种实验方法

诱饵（Bait）——DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi 载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图2）

图 2. 通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株。ura3-52基因位于Y1HGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野生型中的URA3 gene同源重组才可以修复。而pBait-AbAi载体就包含URA3 gene。当用BstBI 或BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold，转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。

C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库（图3）

图3利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec 末端具有同源序列。将cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同源重组。将酵母细胞涂布于SD/-Leu/+AbA培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。

探寻蛋白-DNA的相互作用——Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.5 礸/ml) 下即可对酵母产生毒性。包含AbA r gene（AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait），GAL4 AD就会激活AbA r 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长（图1）。

Matchmaker Gold One-hybrid技术可被用于：

鉴定新的蛋白-DNA的互作

验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作

明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列