叶绿体基因工程的特点

1988年，Boynton等首次用野 生型叶绿体DNA转化了单细胞生物 －衣藻－突变体（atpB基因突变 体），使其完全恢复光合作用能力， 标志着叶绿体基因工程的诞生； 1990年，高等植物烟草的叶绿体转 化获得成功，叶绿体转化的优势逐 渐被人们认识并利用。
2. 叶绿体DNA简介
叶绿体是绿色植物光合作用的场所，来 源于古代的藻类原核生物，含有双链环状 DNA（Manning,1971）叶绿体DNA有IRA和 IRB两个反向重复序列（分别位于A链和B 链），两者基因大小完全相同，只是方向相 反，它们之间有一个大的单拷贝区（long single copy，LSC）大小约80Kb，和一个 小的单拷贝区（short single copy，SSC）， 大小约20Kb。多数叶绿体DNA大小在 120~160Kb，最大2000Kb（伞藻），最小 85Kb（刺海松）。
4.7 便于遗传操作
叶绿体基因组小，结构简单， 不与组蛋白结合，使遗传操作易于 进行。烟草、水稻、玉米等高等植 物的叶绿体基因组全序列已被测定， 遗传背景较清楚，这更有利于对叶 绿体进行转化。
5. 绿体转化存在的问题
5.1 5.2 5.3 5.4 叶绿体转化的同质化问题 植物的种类有待扩展 选择标记基因 缺乏表达的组织发育专一性
叶绿体基因组中的基因在漫长的 进化历程中，有许多转移到了核中， 遗留在叶绿体中的基因是功能必需的 一些基因，有巨大的拷贝数（一个叶 绿体中，基因拷贝数可达上百个；一 个细胞中，基因的拷贝数可达上万 个），而且它们都是原核生物来源的， 具有原核生物基因的特点。叶绿体基 因多为多顺反子转录单位，这些转录 单位中基因的排列顺序是高度保守的。
4.2 安全性好
转基因植物的安全性是基因工 程中一个很重要的问题。绝大多数 植物的叶绿体基因为母系遗传，外 源基因整合进叶绿体基因组后不会 扩散，因此不会发生核基因工程那 样因花粉传递而可能造成的“基因 逃逸”问题。
4.3 外源基因定点整合
核转化中外源基因的插入是随机的， 产生“位置效应”。这要求大量筛选以找 到需要的转化植株，而且随机插入很难控 制，可能引起转基因失活，使转化后的表 型不能真正反映外源基因的功能。而叶绿 体的基因在不同物种中是高度保守的，可 以利用同源整合将外源基因定点插入到两 个基因之间，并不影响叶绿体原有基因的 表达。外源基因在叶绿体的定点整合已在 烟草、拟南芥和马铃薯中获得成功。
叶绿体是母系遗传，所以 一旦得到纯合而稳定的叶绿体 转化体，这种纯系的种子后代 将永远保持为纯系，不会因为 有性杂交发生分离。
4.6 可直接表达原核基因
叶绿体基因组无组蛋白，其大 多数基因的排列方式、转录与翻译 系统均与原核生物类似，因此来自 原核生物的外源基因无需改造和修 饰就可在叶绿体高效表达，这是核 基因转化无法做到的。
5.2 植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因 组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建 的同源重组片段和外源基因的插入位点。 目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄 和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定 遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积 累的可食用果实的植物。
5.3 选择标记基因
利用叶绿体基因工程还实现了对光 合作用关键酶Rubisco的操纵， Whitney SM等用Rhodospiridium rubrum(红冬孢酵母属)的B f Rubisco 取代了烟草Rubisco大亚基编码基因 rbcl，从而创造了第一株有生存能力且 Rubisco特性得到改造的植物，将更高 效的Rubisco转入植物叶绿体有望提高 光合作用效率，从而增加农作物产量。
烟草叶绿体遗传转化所用的十分有效 的选择标记基因是抗壮观霉素(aadA)基因, 而高等植物核转化表明这种选择标记基因 对部分具抗生素耐性的双子叶植物和单子 叶植物选择效率低,无法得到大量转化植株。 因此有效的选择标记基因是实现扩大叶绿 体遗传转化植物种类的关键因素。最近, 利 用绿色荧光蛋白( GFP) 和氨基糖苷磷酸转 移酶作为筛选标记的研究已取得一定的进 展。
6. 叶绿体遗传转化的前景展望
6.1 促进理论研究 6.2 提高光合效率，增加农作物产量 6.3 研制生物反应器 6.4 提高植物杭性 6.5 提高蔬菜营养价值
6.1 促进理论研究
解决叶绿体基因表达调控机制、核质 基因的相互作用、光合作用的机理、叶绿 体基因的。
6.2 提高光合效率，增加农作物产量
6.3 研制生物反应器
由于叶绿体可高效表达外源基 因，故可能成为工业用酶或药用蛋 白如生长因子、干扰素、抗体、疫 苗等产品的生物反应器。 2000年 Sturb等以叶绿体作为生物反应器 生产出具生物活性的人类生长激素 蛋白，表达量比核系统高300倍。
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2001年Ruf将外源基因转到番 茄叶绿体中，在果实特化叶绿体— —有色体内大量表达，在果实中得 到了较高的外源蛋白。生产可口服 的疫苗、抗体等开辟了道路。2002 年张景煌等将聚3-羚基丁酸醋合成 相关基因导入了烟草叶绿体中，为 生产新型生物可降解塑料提供了可 行途径。
5.1 叶绿体转化的同质化问题
由于高等植物的每个细胞中有 10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100 个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和 未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因 植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定 的。在转化外源基因之前,目前可采用降低 叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变 体作为外源基因的受体等方法使转基因植 株易于同质化。
叶绿体基因工程的特点
主讲内容
1. 前言 2. 叶绿体DNA简介 3. 叶绿体转化的步骤 4. 叶绿体转化较核转化的优越性 5. 绿体转化存在的问题 6. 叶绿体遗传转化的 前景展望
1. 前言
1882年，Straburger观察到藻 类叶绿体能分裂并进入子代细胞； 1909年，Baur和Correns通过在三 种枝条颜色不同的紫茉莉之间进行 杂交得出结论:质体是母本遗传的。 这两项发现引起了人们对叶绿体遗 传的研究兴趣。
4.1 高效表达 4.2 安全性好 4.3 外源基因定点整合 4.4 多顺反子形式表达基因 4.5 易保持纯系 4.6 可直接表达原核基因 4.7 便于遗传操作
4.1高效表达
叶绿体转化的最大优点是外源基因的高 效表达。叶绿体基因在每个细胞中的数目 高达500-10000拷贝，较核基因组可显著提 高所转入外源基因的拷贝数，从而使基因 表达产物成倍增加;若在基因拷贝增加的同 时使用叶绿体特异性表达的强启动子，则 可大大提高外源基因的表达量。如Mcbride 等将Bt毒素基因转人烟草叶绿体，Bt毒素蛋 白的表达量高达叶片总蛋白的3%-5%,而通 常的核转化技术只能达到0.01%-0.6%。
4.4 多顺反子形式表达基因
叶绿体中功能相似的基因常存在 于同一操纵子中并同时表达，所以外 源基因也可以多顺反子的形式转化叶 绿体并正常表达，避免了核基因工程 中多基因转化时常出现的基因沉默现 象，有利于标记基因、目的基因及功 能相关基因的共同转化，也使一次转 化中形成整条代谢途径成为可能。
4.5 易保持纯系
3. 叶绿体转化的步骤
3.1 将外源DNA导入叶绿体 3.2 外源DNA整合进入叶绿体基因组 3.3 筛选叶绿体转化的细胞 3.4 再生稳定的转基因植株
3.1 将外源DNA导入叶绿体
外源DNA穿过叶绿体的双层膜比 穿过核膜要困难得多，叶绿体转化的 一个关键问题是DNA进人细胞质后如 何穿过叶绿体双层膜。目前最常用和 最有效的方法是基因枪法，转化效率 高且重复性好。此外还有农杆菌介导 法、聚乙二醇(PEG)介导法、显微注 射法等。
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6.4 提高植物杭性
目前抗性育种基因工程所用的外源基因 大多来自原核生物，多年来采用的核基因 技术需对这些基因修饰或重新合成，耗费 大量财力但收效不大，且易出现“基因逃 逸”。而采用叶绿体转化技术时外源基因 无需改造且超量表达，是农作物抗性育种 的一条新途径。抗除草基(EPSPS)、抗病 原体蛋白基因( MS1-99 )、抗虫基因(Cry)、 耐盐基因( tps1,BADH)均已实现了在叶绿体 中的高效表达。
3.2 外源DNA整合进入叶绿体 基因组
用于叶绿体基因转化的质粒 载体具有叶绿体基因组的同源片段、 启动子及适于叶绿体表达的筛选标 记，转化载体被载入叶绿体后通过 与叶绿体基因组的同源片段之间发 生两次同源重组，将外源基因整合 到基因组特定位点。
3.3 筛选叶绿体转化的细胞
高等植物中，每个叶绿体内又有 数百个基因组拷贝，因此转化和未转 化的叶绿体极易同时存在于转基因植 株中，这种杂合体遗传不稳定。解决 该问题的方法之一是在得到外源基因 的转化子后，在增加选择压力的培养 基上反复筛选，逐步淘汰野生型拷贝， 最终使转基因植株中已整合外源基因 的叶绿体基因组取代原基因组所有拷 贝，即同质化。
6.5 提高蔬菜营养价值
叶绿体是许多代谢反应的发生场 所，参与氨基酸、脂肪酸和淀粉等物 质的生物合成。对这些代谢反应的关 键酶基因进行改造，或者直接导入外 源蛋白基因，可望在蔬菜叶子中大幅 度提高人类必需氨基酸、脂肪酸、糖 类与蛋白质含量。
7. 结语
叶绿 体 基 因工程是一门年轻的 技术，虽然前景诱人，但还存在一些 难以解决的问题。目前已成功转化的 植物种类少，在已转化的几种植物中 也只有烟草和番茄能通过有性生殖使 外源基因稳定遗传，人类的主要作物 都未实现真正的叶绿体转化。随着叶 绿体基因表达、调控机制研究的日益 深入和叶绿体转化技术的不断完善， 叶绿体基因工程必将为遗传工程带来 新的生机和活力。
3.4 再生稳定的转基因植株
目前常用的植物组织再生方式有 愈伤组织再生和原生质体再生。转化 外植体经脱分化培养诱导形成愈伤组 织后，再通过分化培养诱导生根、发 芽获得再生植株，将再生植株移栽土 壤就可长成可育的成年植株。再生系 统的遗传稳定性与再生方式、培养条 件、外植体的选择等有关。
4. 叶绿体转化较核转化的优越性
5.4 缺乏表达的组织发育专一性
叶绿体基因组的启动子中除了光调 控启动子具有组织专一性外,一般都没 有组织专一性,特别是发育专一性表达 的特性,而对于转基因植物来说,为了保 障不影响细胞正常代谢,提高细胞内物 质能量的有效利用率,常要求外源基因 能够具有可调控的组织或时间上的特 异性表达,表达调控元件的选择对外源 基因的高效表达至关重要。