耶尔森氏菌检验(详细)
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Sereny 试验，有人将 11 株小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌悬液接种于豚鼠眼结膜，有 6 株 引起严重的角膜结膜炎，即 Sereny 试验阳性。这 6 株均为 O8 血清型。
3、自凝性。
1980 年 Laird 等人提出了一种测定本菌毒力的简易方法，即将试验菌接种于二管含 10% 小牛血清的组织培养液内，分别置 22℃和 36+1℃培养，若 22℃培养，菌液混浊，而 37℃培 养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。在检查的 180 株菌中有 25 株阳性，这些阳性菌株均能引起腹泻。
二、流行病学
1、细菌分布
小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙 拉、牡蛎、哈和虾。也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已从家畜、狗、猫、山 羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥 可能是带菌者。
猪的带菌率较高，日本报告检出率为 4%，加拿大为 3.6%，丹麦为 10-17%。在猪中，该 菌最易在扁桃腺中发现。
3、将经 10 天培养的增菌肉汤充分混合，转移 0.1mL 至 1mL 0.5%盐水（含 0.5%KOH）中， 混合 5-10 秒。连续划线于麦康凯平板和 CIN 平板。另取 0.1mL 增菌液至 1mL 0.5%盐水中， 如上在划线前混合 5-10 秒。置平板于 30℃培养 1 天。
B、细菌分离。
5、毒性质粒。
耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有 41-48Mdal 的质粒有关。这被认为是毒性质粒， 即与毒力有关的质粒。有人将失去毒性质粒的 O8、O3 和 O9 型菌株用小鼠作喂饲试验，均不 发病，但用带毒性质粒的 O8 和 O3 型菌株试验时，小鼠则均发生腹泻或死亡。且菌株自凝试 验的结果与毒性质粒的存在与否相一致。
C、鉴定
将 LAIA 斜面上的培养物划线接种于厌氧卵黄琼脂（AEY），置室温培养。使用 AEY 上的 生长物进行纯度检查、脂肪酶反应（2-5 天）氧化酶试验、革兰氏染色、和生化试验的接种。 将 AEY 上的菌落接种于生化试验培养基，置室温培养 3 天（动力试验培养基和 MR-VP 肉汤在 35-37℃培养 1 天）。
2、侵袭性
Hela 细胞感染，血清型 O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21 和 O22 都能 侵入 Hela 细胞，鉴于 Hela 细胞感染阳性株多是人类致病的常见血清型，以及从人和动物死 亡所见肠类的侵入模型，表明 Hela 细胞侵入性在小肠结肠炎耶尔森氏菌腹泻的发病机理上 是重要的。
3、生化特性
表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别
反应
鼠 疫 假结核耶 小肠结肠 中间型耶 费 氏 克 氏 耶氏菌 氏菌 炎耶氏菌 氏菌 耶氏菌 耶氏菌
赖氨酸
-
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-
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精氨酸
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鸟氨酸
-
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+
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动力(22-26℃)
-
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动力(35-37℃)
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尿素
-
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苯丙氨酸
-
-
耶尔森氏菌检验
耶尔森氏菌属包括 11 个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核 菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏 菌引起黑疽病，不通过食品传染。
1981 年根据 DNA 以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为密切 3 个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌（Y·frederiksenii）、中 间型耶尔森氏菌（Y·intermedia）和克氏耶尔森氏菌（Y·krislensenii）。
本菌对易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。
三、致病性
1、肠毒素
该菌能产生耐热性肠毒素，（分子量为 10000-50000），能耐热 121℃30 分钟，能在 4 ℃保存 7 个月，pH1-11 中稳定。但肠毒素的产生仅限于 22-25℃。血清型 03、08 和 09 几乎 经常产生肠毒素，在其他血清型中也有产生肠毒素的菌株。该肠毒素被摄入即可引起发病。
3、临床症状
小肠结肠炎耶尔森氏菌是 30 年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜 共患病。潜伏期约摄食后 3-7 天，也有报导 11 天才发病。病程一般为 1-3 天，但有些病例 持续 5-14 天或更长。主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。耶尔 森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一 个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。
4、VW 抗原
已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌在免疫学上相同的 VW 抗原。其在 37℃生长时需要钙而在 25℃生长时不需要钙的菌株即含 VW 抗原。Karmali 等人 将从病人粪便检出的 O21 血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于 35℃培养不生长，用 于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上 35℃无生长能力是一致的，能使小 鼠发生腹泻。
D、解释
耶尔森氏菌为氧化酶阴性、革兰氏阴性的杆菌，表 1 和表 2 可用于鉴定耶氏菌的菌株和 生物型。目前已知小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型为 1B、2、3、4、5 具有致病性，这些生物 型和第 6 生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七叶甙和发酵水杨甙。生物型 6 和克氏耶氏菌 相当少，可以通过微弱发酵蔗糖加以区别，并且吡嗪酰胺酶均为阳性反应。对于生物型 1B、 2、3、4、5 的小肠结肠炎耶氏菌可进一步进行致病性测试。
检查经 1 天培养的麦康凯平板，排除红色或粘液状菌落，挑取小的（直径 1-2mm），偏 平，无色的或淡粉红色菌落。同时检查 CIN 平板，挑取具有紧红色中心整个边缘明显无色的 小菌落（直径 1-2mm）。用接种针将所选菌落穿刺接种于赖氨酸精氨酸铁琼脂（LAIA）斜面。 Christensen;s 尿素琼脂平板或斜面。胆汁七叶甙琼脂平板或斜面。室温培养 48 小时。在 LAIA 中的培养物会产生硷性斜面，酸性底层，不产生气体和 H2S（KA--）的反应，被认为是 尿素酶阳性的可疑耶氏菌。去除在 LAIA 中产 H2S 或产气或尿素酶阴性的培养物。
+/-
+
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-/+
七叶甙Βιβλιοθήκη ++
+/-
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-
脂酶
-
-
+/-
+/-
+/- +/-
吡嗪酰胺酶
-
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+/-
+
+
+
4、生物型 小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前 FDA 细菌分析手册第八版中采用
的是 Wanters 1981 的分型方法。
表二：小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型
生化测试
生物型反应
1A
1B
2
耶尔森氏菌为兼性厌氧菌，生长温度为-1 ～48℃，能在反复冷冻，缓化下存活。由于 该菌可在 4℃下进行冷增菌，因此保存在 4-5℃冰箱中的食品具有污染的危险。该菌要求较 高的水活度，最低水活度为 0.95，pH 接近中性，较低的耐盐性。对加热、消毒剂敏感。
控制耶尔森氏菌的关键因素包括适当的蒸煮或巴氏灭菌，适宜的食品处理以防止二次污 染。进行水处理、合理使用消毒剂等控制措施。
2、流行情况
确定耶尔森氏菌作为一种食源性疾病的有关特性了解较多，其在世界范围内已爆发多 起，食品和饮水受到污染，往往是爆发胃肠炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地区暴 发过两起，有 138 名儿童感染，源于摄入生牛奶。1976 年在美国纽约爆发过一起，有 217
名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980 年发生于华盛顿的一起 有 87 人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发， 在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区， 该菌是冬春季腹泻的重要病原菌，根据陈元川案（1984）于不同季节对猪带菌动态的调查， 发现两个养猪场仅在冬春两季有该菌检出，检出的菌株均为 O3 血清型。
一、生物学特性
1、形态特性
本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为 1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列 成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在 30℃以下培养条件形成， 温度较高时即丧失，因此表现为 30℃以下有动力，而 35℃以上则无动力。
2、培养特性
本菌生长温度为 30-37℃，但在 22-29℃才能使本菌的某些特性出现。4℃时能保存和繁 殖。本菌世代时间长，最短亦需 40 分钟左右。在 SS 或麦康凯琼脂上于 25℃经 24 小时培养， 菌落细小，至 48 小时直径才增大成 0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起， 透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本 菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。
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脱氨基酶
甘露醇
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山梨醇
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纤维二糖
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核糖醇
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肌醇
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蔗糖
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鼠李糖
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棉子糖
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蜜二糖
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枸橼酸盐
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V-P
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+/-
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吲哚
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水杨甙
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4
5
6
脂酶
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七叶甙/水杨甙
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(24h)
吲哚
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木糖
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V
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海藻糖
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吡嗪酰胺酶
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β-D 葡糖甙酶
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-
V-P
+
+
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+/-c
+
(+)
-
注：( ) 表示迟缓反应 V 表示可变反应 C 在日本发现血清型为 0:3 的生物型
5、血清型
四、检验与控制
A、增菌
1、无菌称取 25.0g 样品于 225mL，蛋白胨山梨醇胆汁肉汤（PSBB）中，均质 30 秒，置 10℃培养 10 天。
2、如果怀疑产品为高含量耶氏菌，在肉汤培养前各取 0.1mL 划线于麦康凯琼脂和 cefsulodin;irgasan;新生霉素(CIN)琼脂。然后取 1mL 均质液至 9mL 0.5%盐水(含 0.5%KOH) 中，混合数秒钟，各取 0.1mL 划线麦康凯和 CIN 琼脂平板。将平板置 30℃培养 1 天，把平 板上生长的菌落转移到 Whatmam541 滤纸上，用于 DNA 克隆杂交技术直接检测耶氏菌的致病 基因。如果耶氏菌含量较低，省去这一步。
小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株根据其耐热性和耐受高压灭菌的菌体抗原能被血清学分型。 Wanters 将小肠结肠炎耶尔森氏菌和相关菌归纳为 54 个血清群，Aleksii 和 Bockemuh 等人 提议将小肠耶氏菌的血清群简化为 18 个群。目前下列血清群的致病菌株已通过鉴定，它们 是 0:1,2a,3；0:2a,3；0:3；0:8；0:9；0:4,32；0:5,27；0:12,25；0:13a,13b;0:19；0:20； 0:21。引起人类疾病的主要血清群是 0:3,0:8,0:9 和 0:5,27。
3、自凝性。
1980 年 Laird 等人提出了一种测定本菌毒力的简易方法，即将试验菌接种于二管含 10% 小牛血清的组织培养液内，分别置 22℃和 36+1℃培养，若 22℃培养，菌液混浊，而 37℃培 养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。在检查的 180 株菌中有 25 株阳性，这些阳性菌株均能引起腹泻。
二、流行病学
1、细菌分布
小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙 拉、牡蛎、哈和虾。也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已从家畜、狗、猫、山 羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥 可能是带菌者。
猪的带菌率较高，日本报告检出率为 4%，加拿大为 3.6%，丹麦为 10-17%。在猪中，该 菌最易在扁桃腺中发现。
3、将经 10 天培养的增菌肉汤充分混合，转移 0.1mL 至 1mL 0.5%盐水（含 0.5%KOH）中， 混合 5-10 秒。连续划线于麦康凯平板和 CIN 平板。另取 0.1mL 增菌液至 1mL 0.5%盐水中， 如上在划线前混合 5-10 秒。置平板于 30℃培养 1 天。
B、细菌分离。
5、毒性质粒。
耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有 41-48Mdal 的质粒有关。这被认为是毒性质粒， 即与毒力有关的质粒。有人将失去毒性质粒的 O8、O3 和 O9 型菌株用小鼠作喂饲试验，均不 发病，但用带毒性质粒的 O8 和 O3 型菌株试验时，小鼠则均发生腹泻或死亡。且菌株自凝试 验的结果与毒性质粒的存在与否相一致。
C、鉴定
将 LAIA 斜面上的培养物划线接种于厌氧卵黄琼脂（AEY），置室温培养。使用 AEY 上的 生长物进行纯度检查、脂肪酶反应（2-5 天）氧化酶试验、革兰氏染色、和生化试验的接种。 将 AEY 上的菌落接种于生化试验培养基，置室温培养 3 天（动力试验培养基和 MR-VP 肉汤在 35-37℃培养 1 天）。
2、侵袭性
Hela 细胞感染，血清型 O1、O3、O4、O5B、O8、O9、O15、O18、O20、O21 和 O22 都能 侵入 Hela 细胞，鉴于 Hela 细胞感染阳性株多是人类致病的常见血清型，以及从人和动物死 亡所见肠类的侵入模型，表明 Hela 细胞侵入性在小肠结肠炎耶尔森氏菌腹泻的发病机理上 是重要的。
3、生化特性
表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别
反应
鼠 疫 假结核耶 小肠结肠 中间型耶 费 氏 克 氏 耶氏菌 氏菌 炎耶氏菌 氏菌 耶氏菌 耶氏菌
赖氨酸
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耶尔森氏菌检验
耶尔森氏菌属包括 11 个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核 菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏 菌引起黑疽病，不通过食品传染。
1981 年根据 DNA 以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为密切 3 个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌（Y·frederiksenii）、中 间型耶尔森氏菌（Y·intermedia）和克氏耶尔森氏菌（Y·krislensenii）。
本菌对易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。
三、致病性
1、肠毒素
该菌能产生耐热性肠毒素，（分子量为 10000-50000），能耐热 121℃30 分钟，能在 4 ℃保存 7 个月，pH1-11 中稳定。但肠毒素的产生仅限于 22-25℃。血清型 03、08 和 09 几乎 经常产生肠毒素，在其他血清型中也有产生肠毒素的菌株。该肠毒素被摄入即可引起发病。
3、临床症状
小肠结肠炎耶尔森氏菌是 30 年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜 共患病。潜伏期约摄食后 3-7 天，也有报导 11 天才发病。病程一般为 1-3 天，但有些病例 持续 5-14 天或更长。主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。耶尔 森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一 个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。
4、VW 抗原
已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌在免疫学上相同的 VW 抗原。其在 37℃生长时需要钙而在 25℃生长时不需要钙的菌株即含 VW 抗原。Karmali 等人 将从病人粪便检出的 O21 血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于 35℃培养不生长，用 于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上 35℃无生长能力是一致的，能使小 鼠发生腹泻。
D、解释
耶尔森氏菌为氧化酶阴性、革兰氏阴性的杆菌，表 1 和表 2 可用于鉴定耶氏菌的菌株和 生物型。目前已知小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型为 1B、2、3、4、5 具有致病性，这些生物 型和第 6 生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七叶甙和发酵水杨甙。生物型 6 和克氏耶氏菌 相当少，可以通过微弱发酵蔗糖加以区别，并且吡嗪酰胺酶均为阳性反应。对于生物型 1B、 2、3、4、5 的小肠结肠炎耶氏菌可进一步进行致病性测试。
检查经 1 天培养的麦康凯平板，排除红色或粘液状菌落，挑取小的（直径 1-2mm），偏 平，无色的或淡粉红色菌落。同时检查 CIN 平板，挑取具有紧红色中心整个边缘明显无色的 小菌落（直径 1-2mm）。用接种针将所选菌落穿刺接种于赖氨酸精氨酸铁琼脂（LAIA）斜面。 Christensen;s 尿素琼脂平板或斜面。胆汁七叶甙琼脂平板或斜面。室温培养 48 小时。在 LAIA 中的培养物会产生硷性斜面，酸性底层，不产生气体和 H2S（KA--）的反应，被认为是 尿素酶阳性的可疑耶氏菌。去除在 LAIA 中产 H2S 或产气或尿素酶阴性的培养物。
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4、生物型 小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前 FDA 细菌分析手册第八版中采用
的是 Wanters 1981 的分型方法。
表二：小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型
生化测试
生物型反应
1A
1B
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耶尔森氏菌为兼性厌氧菌，生长温度为-1 ～48℃，能在反复冷冻，缓化下存活。由于 该菌可在 4℃下进行冷增菌，因此保存在 4-5℃冰箱中的食品具有污染的危险。该菌要求较 高的水活度，最低水活度为 0.95，pH 接近中性，较低的耐盐性。对加热、消毒剂敏感。
控制耶尔森氏菌的关键因素包括适当的蒸煮或巴氏灭菌，适宜的食品处理以防止二次污 染。进行水处理、合理使用消毒剂等控制措施。
2、流行情况
确定耶尔森氏菌作为一种食源性疾病的有关特性了解较多，其在世界范围内已爆发多 起，食品和饮水受到污染，往往是爆发胃肠炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地区暴 发过两起，有 138 名儿童感染，源于摄入生牛奶。1976 年在美国纽约爆发过一起，有 217
名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980 年发生于华盛顿的一起 有 87 人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发， 在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区， 该菌是冬春季腹泻的重要病原菌，根据陈元川案（1984）于不同季节对猪带菌动态的调查， 发现两个养猪场仅在冬春两季有该菌检出，检出的菌株均为 O3 血清型。
一、生物学特性
1、形态特性
本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为 1-3.5×0.5-1.3μm，多单个散在，有时排列 成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在 30℃以下培养条件形成， 温度较高时即丧失，因此表现为 30℃以下有动力，而 35℃以上则无动力。
2、培养特性
本菌生长温度为 30-37℃，但在 22-29℃才能使本菌的某些特性出现。4℃时能保存和繁 殖。本菌世代时间长，最短亦需 40 分钟左右。在 SS 或麦康凯琼脂上于 25℃经 24 小时培养， 菌落细小，至 48 小时直径才增大成 0.5-3.0mm。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起， 透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本 菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。
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注：( ) 表示迟缓反应 V 表示可变反应 C 在日本发现血清型为 0:3 的生物型
5、血清型
四、检验与控制
A、增菌
1、无菌称取 25.0g 样品于 225mL，蛋白胨山梨醇胆汁肉汤（PSBB）中，均质 30 秒，置 10℃培养 10 天。
2、如果怀疑产品为高含量耶氏菌，在肉汤培养前各取 0.1mL 划线于麦康凯琼脂和 cefsulodin;irgasan;新生霉素(CIN)琼脂。然后取 1mL 均质液至 9mL 0.5%盐水(含 0.5%KOH) 中，混合数秒钟，各取 0.1mL 划线麦康凯和 CIN 琼脂平板。将平板置 30℃培养 1 天，把平 板上生长的菌落转移到 Whatmam541 滤纸上，用于 DNA 克隆杂交技术直接检测耶氏菌的致病 基因。如果耶氏菌含量较低，省去这一步。
小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株根据其耐热性和耐受高压灭菌的菌体抗原能被血清学分型。 Wanters 将小肠结肠炎耶尔森氏菌和相关菌归纳为 54 个血清群，Aleksii 和 Bockemuh 等人 提议将小肠耶氏菌的血清群简化为 18 个群。目前下列血清群的致病菌株已通过鉴定，它们 是 0:1,2a,3；0:2a,3；0:3；0:8；0:9；0:4,32；0:5,27；0:12,25；0:13a,13b;0:19；0:20； 0:21。引起人类疾病的主要血清群是 0:3,0:8,0:9 和 0:5,27。