两种显色方法在免疫组化和原位杂交技术中应用

两种显色方法在免疫组化和原位杂交技术中应用

肖庆邦1，王海青2，郭瑞珍

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关键词：免疫组织化学；原位杂交；显色中图分类号：R 446文献标志码：B

文章编号：1001－7399（2012）11－1288－02

收稿日期：2012－09－14

基金项目：贵州省攻关项目（2010-3080）作者单位：1遵义医学院附属第一医院病理科，遵义563003

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珠海校区病理学教研室，珠海519041

作者简介：肖庆邦，男，实验师。E-mail ：Xqbo113@soh．com 郭瑞珍，女，教授，通讯作者。E-mail ：jichubuyouxiang@si-na．com

免疫组织化学（immunohistochemistry ，IHC ）和原位杂交（in situ hybridization ，ISH ）技术是科研和临床病理诊断工作中经常同时采用的两种技术。在国内这两种方法均是通过二氨基联苯氨（diaminobenzidin ，DAB ）进行最后显色，其阳性信号均显示为棕黄色颗粒。两种方法中IHC 显示的是蛋白水平，而ISH 显示的是分子水平，若仅根据阳性信号的颜色进行区别，宜混淆。为了进行有效的区别，本组实验分别

采用了国内通用的DAB 显色方法和国外应用广泛的3-氨-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethyl-car bazole ，AEC ）显色方法对上述两种方法进行显色，效果满意，有效区分IHC 和ISH 的阳性信号，现报道如下。1材料与方法1．1

材料

选取遵义医学院附属医院病理科2005 2008

年间外检存档的20例皮肤瘢痕鳞状细胞癌（瘢痕癌）蜡块，石蜡组织4μm 厚切片，每例连续切片4张，

60ħ烤箱过夜。采用C-myc 阳性的瘢痕癌作对照。1．2试剂兔抗人MAPK 多克隆抗体、人MAPKmRNA 寡

核苷酸探针原位杂交试剂盒均购于武汉博士德公司；DAB 显色试剂盒及AEC 显色试剂盒均购于福州迈新公司。1．3方法1．3．1IHC

采用免疫组化SP 法检测MAPK 蛋白，

DAB 显色，DAB 试剂配制按DAB 说明书进行，即用0.8ml 双蒸水，滴加1滴试剂A （约50μl ），混合均匀，再滴加1滴试剂B （约50μl ），混合均匀，最后滴加1滴试剂C （约50μl ），混合均匀，放入4ħ冰箱避光保存。1．3．2

ISH

采用ISH 技术检测MAPKmRNA ，AEC 显色，AEC 试剂配制按AEC 说明书进行，配置方法和过程同DAB 试剂。2结果

2．1

IHC 和DAB 显色

按照免疫组化染色操作过程，标

记MAPK 单克隆抗体至显色的前一步，

后用配置好的DAB 显色剂显色。DAB 室温下显色，镜下控制显色时间，充分显色后自来水冲洗终止显色，切片经过复染，脱水，透明后封片观察。DAB 显色3 5min ，阳性信号呈棕黄色、颗粒状，主要定位于细胞质，MAPK 在癌组织中呈强阳性表达（图1）。2．2

ISH 染色和AEC 显色

按照原位杂交技术操作过程

标记MAPKmRNA 到显色的前一步，后用配置好的AEC 显色剂显色。AEC 显色，滴加显色试剂后放入37ħ烤箱，显微镜下控制显色时间，

充分显色后自来水冲洗终止显色，复染后用水溶性的封片剂封片观察。AEC 显色较缓慢，

37ħ烤箱中显色10 12min ，

阳性信号呈红色、颗粒状，主要定位于细胞质，

MAPKmRNA 在癌组织中呈强阳性表达（图2）。①

②

图1DAB 显色，癌组织MAPK 阳性信号呈棕黄色，SP 法图2

AEC 显色，癌组织MAPKmRNA 阳性信号呈红色，

ISH 3

讨论

IHC 和ISH 两种技术均需通过显色剂显色，使终产物形成具有特殊的颜色来显示检测指标的表达位置和表达量，从而应用于肿瘤的临床病理诊断、鉴别诊断及科研工作。

目前，国内普遍使用的显色方法是DAB 显色，显色的阳性信号为棕黄色。国外广泛运用AEC 显色，显色的阳性信

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8821·临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol 2012Nov ；28（11）

号为鲜红色。本组实验对两种不同显色方法进行对比，结果示DAB显色操作比较简单，室温下即可显色，显色时间较快；显色后切片可用二甲苯透明，切片较干净，组织透明度较好；透明后用中性树胶封固，可较长时间保留切片，一般不会掉色；AEC显色颜色比较鲜艳，背景比较淡，敏感性和表达部位显色效果较好。相比之下，DAB显示的颜色比较暗，背景颜色比较重，敏感性和表达的部位不如AEC显色效果好；DAB有致癌性，使用时务必有防毒意识和防毒措施。而AEC显色需在37ħ烤箱中进行，不利于对显色结果进行判断；显色后不能用二甲苯进行透明处理，影响切片的透明度和清晰度；使用水溶性封片剂或甘油等封片不利于切片的长期保存，需及时观察、采集图像并进行统计学分析。两种显色剂和显色方法各有优缺点。

文献［1］报道DAB和AEC两种显色剂易受以下因素影响，如组织固定（固定液的温度、pH值和不同组织）、制片过程（浸蜡温度、包埋温度、烤片温度）、IHC染色过程（如抗原修复的方法、时间、温度、pH值，封闭内源性过氧化物酶的方法、步骤等）和ISH染色过程（如酶蛋白消化的时间、探针的敏感度）等，这些因素对染色结果影响很大。Graham等［2］研究发现使用氧化物酶组织化学的显色剂，可以使显色时间持续更久。

上述两种显色方法对IHC和ISH显色结果进行有效区别，若实验中仅采用其中一种方法时，DAB显色是首选，如果同时选用两种技术进行科学研究时，建议一种技术选用DAB显色，另一种技术选用AEC显色，因为DAB显色结果为棕黄色，EAC显色结果为红色，两种不同的显色颜色有利于操作人员进行视觉鉴别，避免混淆。在今后的工作中，我们建议实验操作人员要从习惯采用DAB显色逐步实践或过度到采用AEC显色，将更有利于环保和健康。

参考文献：

［1］熊正文，李春光，丁华野，等．影响免疫组化敏感性反应的因素分析及对策［J］．中国组织化学与细胞化学杂志，1999，8（2）：

236－9．

［2］Graham R C，Jr Karnowsky M J．The early stage of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney：ultrastructural cytochemistry by a new technique［J］．J Histochem Cytochem，1966，14（4）：291－

302．

肾穿刺活检六胺银染色套染Masson染色方法的改良

吕增华，张杨杨，朱玉红

关键词：肾穿刺活检；六胺银染色套染Masson染色法

中图分类号：R446文献标志码：B

文章编号：1001－7399（2012）11－1289－02

肾穿刺活检是目前诊断肾小球肾炎最可靠的手段，在肾脏穿刺活检病理诊断中，六胺银染色套染Masson染色［1］能精确显示病变肾小球内各种免疫复合物的形态与定位，对诊断肾小球疾病起着至关重要的作用。然而，此方法仍然存在制片时间长、染色效果不稳定等缺点，远不能满足临床需要。为此，本组实验对临床送检的120例肾脏穿刺标本，以传统的六胺银染色套染Masson染色方法为基础，在切片染色时间、方法和质量上进行了改进，现介绍如下。

1材料与方法

收稿日期：2012－07－12

作者单位：滨州医学院附属医院病理科，山东滨州256603

作者简介：吕增华，女，副主任技师。Tel：（0543）3256654，E-mail：bzlzh2010@163．com

张杨杨，女，技师，通讯作者。E-mail：zyy19871102@163．

com 1．1组织来源及处理选取临床肾脏穿刺活检标本120例。所有组织均用PB-FA液（40%甲醛10ml、无水乙醇70 ml、0．01mol/L、pH7.2PBS溶液20ml）固定。脱水、透明、浸蜡、包埋（浸蜡和包埋用蜡系熔点60ħ，溶解过滤后使用）。整个过程在3h内完成。包埋时务必将组织拉平，所有组织须在同一个包埋面上，切片厚1μm，64ħ烤箱烤片30 40min。

1．2储存液的配制按照说明书将国药公司生产的粉装试剂配制成储存液，步骤如下：（1）3%六次甲基四胺（乌洛托品）水溶液；（2）5%硝酸银水溶液棕色瓶装；（3）0.2%氯化金水溶液，前3种储备液4ħ冰箱保存备用；（4）5%硼砂水溶液；（5）0.25%硫代硫酸钠水溶液，（4）和（5）室温保存备用；（6）Masson复合染液（酸性复红1g，丽春红2g，橙黄G2 g，0.25%醋酸300ml）；（7）0.1%固绿水溶液，（6）和（7）室温避光保存备用。

1．3染色步骤（1）切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗；（2）擦干组织周围蒸馏水，滴加3%过碘酸水溶液20min，蒸馏水洗3次；（3）滴加预温的六胺银工作液，水浴60 65ħ染色20min左右（大号培养皿去盖先放入水浴锅预热，将组织切片放入培养皿，并滴加预温的六胺银工作液，在切片上加一塑料盖），镜下示肾小球基膜呈明显黑色，蒸馏水洗3次；

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临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol2012Nov；28（11）