cRGD-siEGFR分子肿瘤靶向性及其抗恶性胶质瘤的体内外作用研究

cRGD-siEGFR分子肿瘤靶向性及其抗恶性胶质瘤的体内外作用

研究

研究背景近年来癌症已成为威胁人类生命与健康的主要致死疾病,对癌症的有效防治已是全球共同面临的难题。目前,手术、放化疗是治疗癌症的常规手段,但存在不良反应多、对人体损伤大以及治疗效果不理想等问题。

近年来,新型的肿瘤分子靶向药物逐渐进入临床,因其具有特异性强、耐受性好、毒副作用相对小等特点,分子靶向药物已成为临床治疗肿瘤的重要手段。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种细胞外蛋白配体的细胞表面受体。

已有大量研究表明,EGFR的异常表达,可激活与肿瘤增殖、分化相关的基因,在肿瘤的发生和发展过程中起着极其重要的作用。目前靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)是当今肿瘤药物研发的重要方向。

临床上针对EGFR的肿瘤靶向药物主要分三类：小分子靶向药物、单克隆抗体和肿瘤疫苗,如常用的西妥昔单抗、帕尼单抗等。肿瘤靶向药物的问世为临床治疗肿瘤发挥了巨大的作用,但随着临床的广泛应用,与这些靶向药物相关的严重不良反应不断涌现,且逐渐产生的耐药性问题已成为肿瘤靶向药物研究的又一个挑战,如何满足迫切的临床需求,研发新型的肿瘤靶向药物变得尤为重要。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年发展起来的一种新技术。RNAi 是指通过外源性或内源性的双链RNA在体内诱导靶基因mRNA产生特异性降解,进而发挥特异性的基因沉默作用,目前全球已有近60个关于肿瘤和病毒感染的siRNA药物进入到临床试验阶段,RNAi作为一种全新的药物分子展示了巨大的临床应用前景。

通过搜索国际上重要的临床试验注册数据库,如美国、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,因此利用现代生物学技术开发针对EGFR为靶点的siRNA药物具有一定的研究价值和创新性,而且还蕴藏着巨大的潜力和临床应用前景。整合素(integrin)是一种介导细胞核与外环境之间连接的跨膜受体。

作为细胞粘附分子家族的重要成员之一,主要介导细胞之间、细胞与胞外基质之间的粘附,在许多恶性肿瘤细胞表面高表达,但在大多数正常的静止期细胞和组织中几乎不表达,其亚型为αvβ3,。现有研究已证实多肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)可以被αvβ3受体特异性的识别,且环状RGD (cRGD)对αvβ3受体的亲和力、特异性更高。

因此,可以利用cRGD与肿瘤细胞表面高表达的αvβ3受体特异性结合、经受体内吞携带药物分子进入细胞内的特点,人工合cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR mRNA表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临床价值。综上所述,我国恶性肿瘤患者日益增加,目前尚无治愈肿瘤的特效药物,常规的治疗手段毒副作用大,疗效不理想,新型的肿瘤靶向药物虽然从一定程度上显示了临床疗效,但仍存在较多严重不良反应,而且现有的靶向药物仅局限于非小细胞肺癌和乳腺癌等几个病症,加上日益严重的耐药问题已成为这些药物的应用瓶颈,更多的新型肿瘤靶向药物亟待开发,新兴的RNAi 技术为新型肿瘤靶向药物的研究提供了新的手段,为新型高效低毒的肿瘤靶向药物研发带来了希望。

目前国际上重要的临床试验注册数据库、世界卫生组织临床试验注册平台(ICTRP)等,暂未见以EGFR为靶点的siRNA药物的临床注册,

参考文献中也未见以cRGD为靶向配体、EGFR为靶点的siRNA药物研究报道,因

此通过人工合成cRGD-siEGFR分子,研发可特异性靶向肿瘤细胞并沉默EGFR表达的新型肿瘤分子靶向药物,这将具有非常重要的研究意义和临床价值。本论文拟将cRGD肽通过小分子量PEG接头直接共价偶联到特异性沉默EGFR siRNA正义链的末端,得到可特异性沉默肿瘤细胞EGFR mRNA表达的cRGD-siEGFR分子,并考察该分子特异性沉默EGFR mRNA和蛋白的作用、肿瘤靶向性、抗肿瘤活性及其毒副作用和免疫刺激反应,并进一步对肿瘤组织切片,进行免疫组化和TUNEL分析,验证cRGD-siEGFR分子抑制肿瘤细胞增值、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,以及对机体各脏器和组织的毒副作用,探讨cRGD-siEGFR分子作为新型肿瘤分子靶向药物的可行性及其存在的优缺点,也为类似的RNAi药物研究提供参考。

目的1.筛选验证有效沉默EGFR mRNA表达的siRNA序列及其骨架修饰方式。

2.合成cRGD-siEGFR分子并且对其结构和纯度进行鉴定分析。

3.体外研究cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性。

4.体外研究cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性,细胞毒性及其特异性沉默EGFR mRNA表达的功能。

5.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子的肿瘤靶向性及其在体内的代谢分布。

6.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子抗肿瘤生长的生物学活性及其相关机制(基因沉默效率和肿瘤细胞凋亡情况)；

7.荷瘤裸鼠模型研究cRGD-siRNA分子对免疫原性和肝肾功能的影响。

方法1. EGFR siRNA序列验证和骨架修饰通过RT-qPCR法进行对EGFR siRNA 序列沉默EGFR mRNA的效率进行验证,并对验证后的序列进行骨架修饰,主要通过对EGFR siRNA正义链或反义链的5’或3’端进行甲氧基修饰以及关键位置的U 替换为T,以提高siRNA的稳定性,降低免疫原性和脱靶效应。2. cRGD-siEGFR

分子的合成将cRGD肽的氨基与8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(PEG)的羧基脱水缩合,

得到cRGD-PEG,再与3-Maleimidopropionic Acid (MPA)的羧基脱水缩合,得到cRGD-PEG-MPA,最后通过巯基与EGFR siRNA分子正义链的5’端共轭连接,得到

人工合成的cRGD-siEGFR。

LC-MS对合成的cRGD-siEGFR进行结构鉴定,高效液相色谱(HPLC)检测

cRGD-siRNA分子的合成纯度。3. cRGD-siEGFR分子的血浆稳定性未经修饰siRNA、不同骨架修饰EGFR siRNA、以及合成的双链cRGD-siEGFR分子,与小鼠新鲜血浆1：1混合,在37℃条件孵育不同时间后,采用1.2%琼脂糖凝胶电泳测定其稳定性。

4. cRGD-siEGFR分子体外生物学功能研究CCK-8法评价cRGD-siRNA分子的体外细胞毒性。共聚焦显微镜检测Cy5标记siRNA分子在细胞中的分布,以此验证cRGD-siEGFR分子的细胞靶向性。

RT-qPCR和western blot评价cRGD-siEGFR分子在细胞水平抑制EGFR mRNA 和EGFR蛋白表达的作用。流式细胞术定量检测U87 MG细胞对cRGD-siEGFR-cy5的摄取能力。

CCK-8和EDU实验考察cRGD-siEGFR抑制U87MG细胞的增殖作用。流式细胞术测定cRGD-siEGFR诱导U87 MG细胞凋亡的作用。

5. cRGD-siEGFR分子在体内的肿瘤靶向性及其代谢分布。成功建立肿瘤裸

鼠模型后,尾静脉注射Cy5标记的cRGD-siEGFR (lnmol/20g)和EGFR siRNA (lnmol/20g)。

分别在12h、24h、48h、72h进行活体成像。72h后颈椎脱臼法处死小鼠,迅速解剖取出肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾并进行荧光成像,观察各离体器官内siRNA的分布情况。