第8章 氨基酸的代谢控制与发酵

碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。
另一方面，可以通过控制VH的浓度，实现对于乙醛 酸循环的封闭。
研究表明，异柠檬酸裂解酶活性 为醋酸诱导
受琥珀酸的阻遏抑制
当VH缺乏时： （1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱，乙酰辅酶A的生成量 就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低； （2）VH 对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产 物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻 遏和抑制作用加强； 两者综合的作用使得异柠檬酸裂解酶的活性丧失 ， DCA循环得到封闭。
另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。
第二节 谷氨酸发酵的代谢控制育种

1957年日本率先采用微生物发酵法生产谷氨酸，
被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业 进行代谢控制发酵的阶段。 目前全国有近50家工厂生产味精，年产量约为 60万吨，居世界首位。

一、谷氨酸的生物合成与发酵生产
㈠ 谷氨酸生物合成途径
2、生物素对氮代谢的影响
VH丰富时，出现“只长菌，不产酸”的现象
•谷氨酸发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定 量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期， 则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。 • 控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合 成能力，使合成的谷氨酸不能转化成其他氨基酸 或参与蛋白质合成。
㈠ 谷氨酸族（α -酮戊二酸族）
包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸 和脯氨酸； ㈡ 丙酮酸族
包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；
㈢ 天冬氨酸族（草酰乙酸族） 包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮 氨酸； ㈣ 磷酸甘油酸族 包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸； ㈤ 芳香族 包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；

2、饲料领域

组成蛋白质的氨基酸几乎半数对于动物（如猪和家 禽）来说是必需的。

蛋氨酸和赖氨酸的全世界年产量分别为35万吨和40 万吨。
近年来，由于发酵水平的提高，苏氨酸成功地进入 饲料市场，估计全世界年产量已达1.5万吨。 L-色氨酸也是一种限制性氨基酸，尤其在以玉米为 基础的饲料中。但由于生产成本较高，目前L-色氨 酸的世界年产量仅500吨（日本400吨），因此还不能 广泛作为饲料添加剂使用。
生物素
表面活性剂
阻断脂肪酸的合成 对生物素有拮抗
影响细胞膜的合成 影响细胞膜的合成 细胞膜损伤
阻断脂肪酸的合成 抑制细胞壁合成
在对数生长期添加青霉素 甘油缺陷型 油酸缺陷型
磷脂的合成受阻
影响细胞膜的合成 影响细胞膜的合成
阻断不饱和脂肪酸的合成
提高细胞膜的 谷氨酸通透性
控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂） 青霉素损伤细胞壁，间接影响细胞膜 通过油酸的合成 通过甘油合成 直接控制磷脂合成
一、氨基酸的应用与市场

氨基酸的应用是基于它们的营养价值、风味、 生理活性和化学特性。

主要应用领域是食品、饲料、化妆品、医药，
也用作化学工业的中间体。据估计全世界每
年氨基酸市场为40－50亿美元，其中35%用
于食品、50%用于饲料和15%用于医药和化
妆品。
1、食品领域

氨基酸大多无味，但它们是自然芳香的前体。
控制磷脂含量
二、谷氨酸生物合成的调节机制
㈠谷氨酸生物合成的调节
①谷氨酸脱氢酶 ②-酮戊二酸脱氢酶 ③磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 ④柠檬酸合成酶
所以，正常代谢不积累Glu 在微生物的代谢中，Glu比Asp优先合成； 合成过量时则抑制谷氨酸脱氢酶，使代谢转向合成Asp； Asp过量时反馈抑制PEP羧化酶的活力，停止合成草酰乙酸。

谷氨酸钠（味精）是所有氨基酸中最大生产品种， 全世界年产量达100万吨（中国大陆约为60万吨）。
二肽和寡肽大多具有苦味，但二肽L-门冬氨酰-L苯丙氨酸甲酯（Aspartame，阿斯巴甜）是个例外， 它比蔗糖甜150－200倍，现已广泛作为人造甜味剂， 应用于低热量的饮料等。目前，阿斯巴甜的世界 年产量已超过2万吨。


以葡萄糖为原料发酵生成谷氨酸时，通过 控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸 裂解酶的活性。 另外，该酶受琥珀酸阻遏，生物素亚适量 时因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸 就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的 合成，乙醛酸循环基本上是封闭的，代谢 流向异柠檬酸→α-酮戊二酸→谷氨酸的方向 高效率地移动。
生物产生的酶来制造氨基酸，如以延胡索酸和
铵盐为原料，经天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨
酸）；

5）应用基因工程、蛋白质工程和代谢工程方法 育成的菌株，进行发酵生产（L-羟脯氨酸）。
氨基酸本身的合成在不同生物体中，有较 大的差异，但是许多氨基酸的合成途径在不同 生物体中也有共同之处。 按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：
菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联
提供NADPH,用于还原α-酮戊二酸生成谷氨酸
氨的导入 合成谷氨酸的反应有3种：
谷氨酸脱氢酶GDH
α-酮戊二酸 + NH4+ + NADPH
α -酮戊二酸+天冬氨酸或丙氨酸
谷氨酸 + H2O + NADP
谷氨酸转氨酶AT 谷氨酸合成酶GS
⑫谷氨酸脱氢酶(GDH)的调节 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸对其反馈抑制和反馈阻遏
L-丙氨酸等）； 2）使用突变株生产氨基酸（L-赖氨酸、L-苏氨酸、 L-缬氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸、L-高 丝氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-组

氨酸等）；

3）使用添加前体的方法生产氨基酸（如用邻氨基
苯甲酸生产L-色氨酸；甘氨酸生产L-丝氨酸等）；

4）使用酶法生产氨基酸（利用微生物细胞或微
（1）糖酵解途径 （EMP） （2）磷酸已糖途径 （HMP) （3）三羧酸循环(TCA) （4）乙醛酸循环 （DCA） （5）二氧化碳固定反应 （6）α-KGA的还原氨基化反应
①苹果酸酶
②丙酮酸羧化酶 ③磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶
CO2固定反应(丙酮酸羧化支路)
㈡ 谷氨酸glutamic acid合成的内在因素
谷氨酸 +α-酮戊二酸 2谷氨酸 + NADP
α-酮戊二酸+谷氨酰胺+NADPH
㈢ 谷氨酸生物合成的理想途径
此时，谷氨酸对糖的转化率达到81.7%；目前，国内 的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内。
㈣ 生物素（ VH）对谷氨酸发酵的影响
1、生物素对糖代谢的影响
生物素参与糖代谢作用：增加糖代谢的速度(对TCA有促进作用） 而丙酮酸氧化脱羧的 速度未改变 丙酮酸积累 乳酸积累
GA产生菌必须具备以下条件
α-酮戊二酸脱氢酶的 活性微弱或缺失
TCA环正常
琥珀酸辅酶A
TCA环阻断， α-酮戊二酸积累
GA产生菌体内的NADPH的氧化能力欠缺或丧失
积累NADPH，抑制α—KGA的脱羧氧化
GA产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶 ——异柠檬酸裂解酶
通过该酶酶活性调节实现DCA循环的封闭，GA积累
二、氨基酸的生产方法

蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸


化学合成法：DL-蛋氨酸，甘氨酸，DL-丙氨酸
微生物发酵法
1956年，木下竹郎（Kinoshita）首次报道分离出谷氨 酸产生菌；次年发酵法工业化生产谷氨酸首先在日本 问世，继而迅速掀起一股氨基酸发酵研究的热潮。 经过半个世纪的努力，目前几乎所有氨基酸都能用微 生物法生产（胱氨酸和半胱氨酸除外）。


3、医药领域

L-氨基酸输液是术前和术后的营养治疗剂。

标准氨基酸输液含有8种必需氨基酸，2种半 必需氨基酸（L-精氨酸和L-组氨酸），以及 几种非必需氨基酸，通常包括甘氨酸、L-丙 氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-谷氨酸。
L-门冬氨酸钾镁常用于消除疲劳和治疗心力衰 竭和肝脏疾病。

4、工业领域
• 谷氨酸生产菌大多是生物素缺陷型，发酵时控制生物素亚适
量，使细胞变形拉长，改变了细胞膜的通透性引起代谢失调使 Glu得以积累。
• 生物素贫乏时，细胞内的Glu含量少而且容易析出，而培养 基中积累大量的Glu；生物素丰富时，培养基中几乎不积累 Glu，而细胞内却含有大量的Glu，且不易被析出。这说明生 物素对细胞膜通透性有重要影响。
细胞膜透性的调节 谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产 菌细胞膜结构与功能发生特异性变化，使细胞膜转变 成有利于谷氨酸向膜外渗透的形态，使终产物不断排 出细胞外，胞内谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓 度，胞内谷氨酸源源不断被优先合成，分泌到发酵培 养基中积累。
细胞透性的调节，一般通过向培养基中添加化学 成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性剂、青霉素 等，达到抑制磷脂、细胞膜的形成或阻碍细胞壁的正 常生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常生理状态，解 除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。
在生物素亚适量的情况下，几乎没有异柠檬酸 裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，苹果酸和草酰乙酸脱 羧反应停滞，在铵离子适量存在下，生成积累谷氨 酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其他氨基 酸和合成蛋白质。
在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶活性 增强，琥珀酸氧化能力增强，丙酮酸氧化力加强， 乙醛酸循环的比例增加，草酰乙酸、苹果酸脱羧反 应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷 氨酸通过转氨作用生成的其他氨基酸量增加。

氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，这 是由于氨基酸的生物合成受到严格的反馈 调节。

要进行氨基酸发酵，就必须采取某些人为 的手段以打破微生物的反馈调节机制，从 而大量积累目的氨基酸。
采用微生物法生产氨基酸的情况如下：

1 ） 使 用 野 生 型 细 菌 生 产 氨 基 酸 （ L- 谷 氨 酸 、