关木通肾毒性及其对肾组织IL-1β、IL-6和NF-κB p65的影响

关木通肾毒性及其对肾组织IL-1β、IL-6和NF-κB p65的影响张娜，谢鸣北京中医药大学方剂学学科（北京，100029）E-mail：xieming603@摘要：目的：观察关木通对大鼠肾组织中NF-κBp65表达的影响及肾脏组织中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的变化。

方法：大鼠随机分为关木通组和正常对照组，关木通组按6 g•kg-1剂量灌胃，正常对照组给予等量蒸馏水，连续8周。

给药结束后，测定大鼠肾脏组织匀浆中IL-1β、IL-6水平，观察肾组织病理改变及用免疫组化染色方法观察大鼠肾组织NF-κBp65的表达。

结果：关木通组大鼠肾脏组织匀浆中IL-1β、IL-6水平均明显高于正常对照组(Ｐ<0 01)；组织切片可观察到以炎症细胞浸润为主的肾小管间质病变，肾间质病变评分、肾小管NF-κBp65的表达均明显高于正常对照组(Ｐ<0 01)。

结论: NF-κBp65的活化可能参与在关木通所致小管-间质的病理损害过程。

关键词：关木通肾小管-间质 NF-κBp65核因子κＢ(nuclear factor kappa B, NF-κB) 是一种介导细胞内信号转导的重要转录因子，由ｐ65和(或)ｐ50蛋白亚基组成的异二聚体是NF-κB主要活化形式，广泛地存在于机体各种组织细胞中，肾脏的肾小球系膜细胞、肾小球上皮细胞、肾小管上皮细胞等均存在NF-κB的调控，与肾脏疾病关系十分密切，如输尿管梗阻或肾毒性物质等所致间质性肾炎中伴有NF-κB活性升高［1,2］，在免疫抑制剂FK506的肾脏毒性损伤中NF-κB起中心调控作用，介导肾皮质单核细胞、巨噬细胞浸润及肾小管损伤和纤维化［3］。

本文首次观察关木通对大鼠肾组织中IL-1β、IL-6和NF-κBp65表达的影响，旨在探讨关木通肾毒性作用机制。

1．材料1.1 药物关木通饮片购自北京市鹤延龄中药饮片公司，经北京中医药大学中药学院生药系刘春生教授鉴定为马兜铃科植物东北马兜铃Aristololochia manshuriensis Kom的干燥藤茎。

水提液制备：分别用相当于药材量7倍体积的冷水浸泡药材1 h，加热至沸，煎煮30 min，倾出药液，残渣再加入5倍体积的水，煎煮20 min；合并两次药液，过滤；水浴浓缩，制成200%浓度的煎液（含2ｇ生药/ml），4℃放置备用。

1.2 动物SD雄性大鼠20只，体重150±10 g，SPF/VAF级，许可证号SCXK(京)2002－0003，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.3 试剂IL-1β、IL-6放免试剂盒，由中国海军总医院提供；兔抗NF-κBp56一抗：武汉博士德生物工程有限公司产品；美国ZYMED公司SP试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司产品；DAB显色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司产品；浓缩型胰蛋白酶消化液：北京- 1 -中杉金桥生物技术有限公司产品；EDTA修复液：北京中杉金桥生物技术有限公司产品；1.4 主要仪器SN-695B型智能放免γ测量仪（上海核所日环光电仪器有限公司）；隔水式恒温培养箱GHP-9080（上海一恒科技有限公司）；LG数码温控微波炉（LG电子有限公司）；美国MIS-2000 SP型3Y显微图象分析仪；日本尼康H8-202显微镜；日本Polaroid数码显微摄像机。

2．方法2.1 分组及处理大鼠按体重随机分为关木通组与正常对照组，每组10只。

关木通组大鼠按6g•kg-1予以关木通煎液，正常对照组予以等量蒸馏水，每日灌胃1次，连续8周。

给药期间大鼠自由摄食饮水。

于灌胃第8周后，处死大鼠，快速取出300mg左右的肾脏组织以1:9重量比加入预冷生理盐水于匀浆器中匀浆，以3000r/min离心15min，取组织上清液，待测IL-1β、IL-6；其他肾组织4%多聚甲醛溶液中固定，经脱水、透明、石蜡包埋后切片，切片厚度为6μm。

2.2 指标检测2.2.1 IL-1β、IL-6：采用放免法测定严格按试剂盒说明书方法进行。

2.2.2肾组织切片行HE染色，光镜检查。

每组10个样本，每样本观察2张切片，每张切片随机观察5个皮质区视野（×200），取平均值。

肾小管间质损伤（TI）根据肾小管扩张和（或）萎缩，肾间质纤维化，炎症细胞浸润累及小管及间质的程度进行评分[4]：肾小管无明显改变．间质中无或极少见炎症细胞，无纤维化组织增生没有肾皮质损害，记0分；肾小管上皮细胞轻度萎缩，变性，坏死轻，呈灶性分布，间质少量炎症细胞浸润，纤维组织增生病变灶性，范围＜25%，记1分；肾小管上皮细胞轻中度萎缩，变性，坏死轻，炎症细胞浸润，纤维组织中度增生病变范围 26％～50％，记2分；肾小管上皮细胞萎缩，变性，坏死重，片状分布，大量弥散或聚集成灶的炎症细胞浸润，纤维组织增生呈多灶或网状成片，病变范围＞50％，记3分。

2.2.3免疫组化染色：石蜡切片常规脱蜡，3% H2O2室温处理10 min，蒸馏水洗2 min 3次，浸于1:50 EDTA修复液中微波96℃～98℃热修复15 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温放置20 min，拭去多余液体，不洗，加入1:50稀释的NF-κBp56，放入湿盒37℃1 h，PBS洗5 min 3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃放置20 min，PBS洗5 min 3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃放置20 min，PBS洗5 min 4次，DAB 显色，室温下作用20 min，蒸馏水洗2 min 3次，吹风机吹干，中性树胶封片，显微镜观察，胞核、胞浆棕黄色为阳性结果，PBS代替一抗作阴性对照。

所得免疫组化染色切片用3Y分析软件（Pro, Ver. 4.0），MIS-2000 SP, Microimage Analysis System，3Y-international Co. LTD, U.S.A. （美国MIS-2000 SP型3Y显微图象分析仪）进行半定量分析。

每组10个样本，每样本观察2张切片，每张切片随机采集5个不重叠视野，取其平均值。

2.3统计方法- 2 -数据以均数±标准差(x±S)表示，采用Student-Newman-Keuls检验，全部数据用SPSS11.5统计软件处理。

3．结果3.1大鼠肾组织IL-1β、IL-6水平结果见表1。

从表1可以看出，与正常对照组比较，关木通组大鼠肾脏匀浆中IL-1β、IL-6水平都明显升高，有显著或极显著性差异（P<0.01）。

x±S，n=10)表1.大鼠肾脏匀浆中IL-1β、IL-6水平比较(组别 IL-1β（ng/mL）IL-6（pg/mL）正常对照组0.274±0.03716.705±6.351关木通组0.370±0.054**28.079±6.609***P<0.05，**P<0.01，与正常对照组比较。

3.2大鼠肾组织改变及病理损害（TI）评分结果见表2。

显微镜下见到正常对照组大鼠肾脏组织镜下肾小球、肾小管结构正常，偶见轻度细胞空泡变性；关木通组大鼠肾间质大量炎性细胞浸润，偶见有肾小球坏死的现象，肾小管上皮细胞重度空泡变性、坏死，并可见双核细胞或核分裂相增多现象，肾间质可观察到纤维细胞增生现象。

从表2可以看出，与正常对照组比较，关木通组大鼠肾小管间质病理积分明显增高，有显著性差异（P<0.01）。

x±S，n=10)表2.大鼠肾小管间质病理损害（TI）定量分析(组别Lesion score正常对照组0.14±0.097关木通组 1.64±0.412***P<0.05，**P<0.01，与正常对照组比较。

3.3 大鼠肾组织NF-κBp56的表达结果见表3。

免疫组化染色片中NF-κBp56阳性细胞胞核、胞浆呈棕黄色，阴性细胞的胞核、胞浆未见棕黄色着染。

显微镜下可见，正常对照组可见肾小管部位有少量染色阳性细胞；关木通组肾小管有胞核深染，胞浆棕黄色的阳性细胞，其着色深，数量多；肾小球部位未见有着染的阳性细胞。

从表4中可以看出，与正常对照组比较，关木通组大鼠肾脏NF-κBp56阳性着染细胞的光密度与阳性着染细胞的细胞数均明显升高，有极显著性差异（P<0.01）。

x±S，n=10)表3大鼠肾脏NF-κBp56定量分析结果(组别光密度阳性细胞数正常对照组0.0136±0.0011 37.3±12.75关木通组0.0169±0.0010** 108.9±15.42***P<0.05，**P<0.01，与正常对照组比较。

- 3 -4．讨论我们曾用单味关木通（6g•kg-1）的剂量连续给大鼠用药8周，可观察到大鼠血清BUN、Scr、尿蛋白、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶与γ-谷胺酰转移酶均显著升高，表明该实验剂量的关木通连续给药8周的确可引起肾功能的损害。

本次实验观察到关木通以该剂量连续给大鼠灌胃8周，可引起大鼠肾组织出现明显的病理变化，主要表现为肾间质的大量炎细胞浸润，纤维组织增生以及肾小管上皮细胞的变性坏死。

曾有报道5 g•kg-1的关木通连续给大鼠灌胃90天，血清BUN、Scr有所升高，肾间质有灶性炎细胞浸润现象[5]和临床部分服用关木通所致肾小管间质肾病的病例中在肾间质纤维化存在局灶性单核炎症细胞浸润的报道[6]，和本次实验结果一致，进一步表明关木通引起的肾损伤以肾间质炎细胞浸润及伴纤维增生为特点。

IL-6是淋巴细胞等炎症细胞的诱导细胞因子，可由肾小管上皮细胞、内皮细胞、Ｔ淋巴细胞和成纤维细胞合成和分泌，肾小管间质损伤，可能刺激自身固有细胞和炎症细胞合成和释放IL-6，使小管间质局部形成高浓度IL-6，IL-1β可诱导肾脏固有细胞及炎症细胞增殖，表达粘附分子受体以及释放炎性介质，即可介导急性时相反应，又与炎症后期纤维化的形成过程有关[7,8 ]。

本实验确实发现损伤肾组织中IL-1β与IL-6水平的显著升高，结果表明关木通引起的肾损害有免疫介导的炎性反应参与。

一般情况下NF-κB与抑制分子I-κB结合以非活性的形式存在于胞浆中。

当受到外界有关因素刺激时，NF-κB与I-κB解离，从胞浆转移到胞核中，参与基因的转录调控。

活化后的NF-κB具有多向性调节作用，广泛参与许多重要基因的转录调控[1]。

有研究表明，NF-κB是前炎症因子基因表达调节的关键成分之一，它诱导前炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子等的表达。

NF-κB在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化，同时伴有炎症细胞的聚集和前炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF合成的增加[9]。