免疫亲和柱_高效液相色谱在白酒赭曲霉毒素A检测中的应用
赭曲霉毒素A标准检测规程
赭曲霉毒素A标准操作规程1、目的为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程，特制订本操作规程。
2、范围本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。
3、检出限和定量限项目岛津安捷伦样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）样本检出限（µg/kg）样本定量限（µg/kg）OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责部门名称部门职责质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。
5.2 溶液配制5.2.1 提取液Ⅰ（用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V甲醇: V水=80 : 20）：取800mL甲醇，加入去离子水定容至1L。
5.2.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）：称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳酸氢钠溶于水中，加0.1mL吐温-20，用水定容至1L。
5.2.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约950mL水中，加水定容至1L。
5.2.5 洗脱液（甲醇: 乙酸=49 : 1）：取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。
5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。
5.3 样品前处理5.3.1 粮食类----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的提取液Ⅰ（见5.2.1）；----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
免疫亲和层析净化液相色谱法检测谷物中赭曲霉毒素A
免疫亲和层析净化液相色谱法检测谷物中赭曲霉毒素A作者：李建忠张舸来源：《粮食科技与经济》2018年第06期【摘要】采用免疫亲和层析净化液相色谱法测定多种谷物（小麦、玉米和大米）样品中的赭曲霉毒素A。
提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，采用高效液相色谱法荧光检测器测定，外标法定量。
结果表明，不同粮食中赭曲霉毒素A在0.5～50.0ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）>0.999；样品在0.3μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg 三个添加水平下的加回收率为84.4%～96.7%；方法检出限为0.3μg/kg，重复性的相对标准偏差为1.03%～3.17%。
【关键词】免疫亲和；层析净化；液相色谱法；赭曲霉毒素A赭曲霉毒素包括A、B、C、D四种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最强、分布最广、对人类和动物影响最大，广泛分布于谷物、饲料及动物体内，对食品污染的范围广泛。
毒理学研究表明，赭曲霉毒素A具有很强的肝脏毒性和肾脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用，许多国家对其制定了严格的限量标准，国际癌症研究机构将其定为2B类致癌物，所以控制谷物中OTA的含量至关重要。
国家标准GB 2761规定谷物及其研磨加工品中OTA限量为5.0μg/kg。
采用国标方法GB5009.96-2016中免疫亲和层析净化液相色谱法，通过加标实验测定阴性样品中OTA含量，采用的方法和所得数据为粮油质检部门提供参考。
1材料与方法1.1材料新收获玉米样品，经国标方法检测后确定为阴性样品。
锤式旋风磨粉碎，85%过孔径为1mm试验筛，制备成玉米粉样品。
1.2主要仪器与试剂LC-2010AHT液相色谱仪，配荧光检测器，日本岛津公司；HQBTWT93不锈钢均质器，北京中检维康生物技术有限公司；N-EVAPl2氮吹仪；CP512百分之一电子天平，上海奥豪斯仪器有限公司；OTA标准物质，浓度均为50.0μg/mL，有国家标准物质证书；甲醇、乙腈、冰乙酸：色谱纯；10倍PBS浓缩液；水为GB/T6682规定的一级水。
粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法编制说明
《粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法》行业标准制定编制说明赭曲霉毒素A主要由曲霉属的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、洋葱曲霉(A．alliaceus)、硫色曲霉(A．sulphureus)、蜂蜜曲霉(A．melleus)、孔曲霉(A．ostianus)、佩特曲霉(A．petrakii)和菌核曲霉(A．sclerotiorum)、黑曲霉（A. niger）等, 青霉属的纯绿青霉（Penicillium verrucosum）、震颤青霉（Penicillium palitans）、团青霉（Penicillium commune）、变紫青霉（Penicillium purpursescens）、圆弧青霉（Penicillium cyclopium）等产生，对人、动物具有致病、致癌作用，被WHO的国际癌症研究组织列为2B级可疑致癌物质。
易污染玉米、大麦、小麦、燕麦、高粱、绿咖啡豆、豌豆、豆类、花生、面包、橄榄、啤酒、饲料、肉、奶酪、奶粉、干草、葡萄干、坚果。
我国食品安全国家标准《GB2761-2011 食品中真菌毒素限量》中规定谷物及豆类制品中赭曲霉毒素A限量为5 μg/kg。
目前报道用于检测赭曲霉毒素A的分析方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、生物传感器法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析、薄层色谱法等。
薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查；普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加，环保性不足；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。
当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的赭曲霉毒素A微量快速定量方法。
为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的赭曲霉毒素A定量分析方法。
免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生-高效液相色谱法检测蜚蠊中的黄曲霉毒素
２０２０年第３７卷第５期［作者简介］ 周颖，女，主管药师，研究方向：药品安全性和质量控制研究。
Ｅ ｍａｉｌ：ｚｙａｙｄ＠１２６ ｃｏｍ［通讯作者］ 昝珂，男，副研究员，研究方向：中药质量控制研究。
Ｅ ｍａｉｌ：６２０６３１０＠ｑｑ ｃｏｍ；马临科，男，副主任中药师，研究方向：中药标准及质量控制研究。
Ｅｍａｉｌ：ｍａｒｌｉｎｋ７８＠１２６ ｃｏｍ免疫亲和柱净化 柱后光化学衍生 高效液相色谱法检测蜚蠊中的黄曲霉毒素周颖１，祝清岚１，马临科１ ，昝珂２（１ 浙江省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，浙江杭州３１００５３；２ 中国食品药品检定研究院，北京１０００５０）［摘要］ 目的：建立检测蜚蠊中黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１和Ｇ２的免疫亲和柱净化 柱后光化学衍生 高效液相色谱法。
方法：样品经过７０％甲醇溶液匀浆提取，用水稀释后经免疫亲和柱富集净化，经Ｃ１８色谱柱分离，以甲醇、乙腈和水为流动相，柱后光化学衍生，荧光检测器进行检测。
结果：在优化的条件下，黄曲霉毒素Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１和Ｇ２线性关系良好，检出限分别为０ ０４，０ ０８，０ ０３和０ ０８μｇ·ｋｇ－１，平均加标回收率为８２ ０％～９０ １％。
结论：该方法快速、准确、灵敏度高，可用于蜚蠊黄曲霉毒素的检测。
［关键词］ 蜚蠊；黄曲霉毒素；光化学衍生；高效液相色谱［中图分类号］ Ｒ２８２ ７４ ［文献标志码］ Ｂ ［文章编号］ ２０９５－３５９３（２０２０）０５－０３５８－０４ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＡｆｌａｔｏｘｉｎｓｉｎＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａｂｙＩｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙＣｏｌｕｍｎａｎｄＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＣｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈＰｏｓｔ ｃｏｌｕｍｎＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＺＨＯＵＹｉｎｇ１，ＺＨＵＱｉｎｇ ｌａｎ１，ＭＡＬｉｎ ｋｅ１ ，ＺＡＮＫｅ２ ［１ ＺｈｅｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＱｕａｌｉｔｙＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＨａｎｇｚｈｏｕ３１００５３，Ｃｈｉｎａ；２ ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００５０，Ｃｈｉｎａ］［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１，Ｂ２，Ｇ１ａｎｄＧ２ｉｎＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａｂｙｉｍｍｕｎｏａｆ ｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎａｎｄｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｐｏｓｔ ｃｏｌｕｍｎｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｓａｍｐｌｅｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈ７０％ｍｅｔｈａｎｏｌａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙｃｏｌｕｍｎ ＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｌｉｑｕｉｄｗａｓｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＣ１８ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｗｉｔｈｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，ａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１，Ｂ２，Ｇ１ａｎｄＧ２ｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ｔｈｅｌｉｍｉｔｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅ０ ０４μｇ·ｋｇ－１ｆｏｒａｆｌａｔｏｘｉｎＢ１，０ ０８μｇ·ｋｇ－１ｆｏｒａｆｌａｔｏｘｉｎＢ２，０ ０３μｇ·ｋｇ－１ｆｏｒａｆｌａｔｏｘｉｎＧ１，０ ０８μｇ·ｋｇ－１ｆｏｒａｆｌａｔｏｘｉｎＧ２Ｔｈｅｍｅａｎｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｓｏｆｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆａｆｌａｔｏｘｉｎｗｅｒｅ８２ ０％－９０ １％ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｒａｐｉｄ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄｃａｎｓａｔｉｓｆｙｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉ ｍｙｃｏｔｏｘｉｎａｎａｌｙｓｉｓｉｎＰｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａ．［ＫｅｙＷｏｒｄｓ］ Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａａｍｅｒｉｃａｎａ；Ａｆｌａｔｏｘｉｎｓ；Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ；ＨＰＬＣ 自然界存在的真菌毒素达２００种以上，其危害性排在首位的是黄曲霉毒素（ａｆｌａｔｏｘｉｎ，ＡＦＴ）［１］。
免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生高效液相色谱法检测粮油中黄曲霉毒素
１ 材料 与方 法
１１ 仪 器 与 试 剂 ．
Ｈ １０ Ｐ １０型 高 效 液相 色 谱 仪 ； １ Ｔ ８型 高速 搅 拌 均 质 器 ； ＭＴ 一 ８ ０ Ｎ ２ ０ Ｄ型 氮 吹仪 ； 化学 衍 生池 （ 光 中检 维康 公 司 ） 和
２ 结果 与讨 论
２１ 免 疫 亲 和 柱 的 应 用 ［ ．
１ ． 提 取 与 净 化 ４
准确 称取 ２． ５０ｇ粮 、 样 品 于 ２ ０ 油 ５ ｍＬ均 质 杯 中 ， 人 加
５ｇ氯 化钠 、２ １５ｍＬ甲醇一 （ 水 体积 比为 ７ ： ， 速均 质 ０３ 高 ０） ２ｍ ｎ 用槽 纹 滤纸 过 滤到 干净 的烧 杯 中 。取 ２ Ｌ滤液 ， ｉ， ０ｍ 加 入 ２ ０ｍＬ水 稀 释 混 匀 ． 玻 璃 纤 维 滤 纸 过 滤 。取 滤 液 用 ｌ ．以 １ ２滴／ ０ｍＬ ～ ｓ的速率将 其通 过 Ａ ａ ｅ Ｐ免疫 亲 和 ｉ ｒ Ｔｓ
亲 和 柱 吸 附 的 杂 质 洗 脱 ， 后 再 用 极 性 强 的 溶 剂 （ 常 用 最 通
甲醇 （ 谱 纯 ）Ａｂ （ ｌ ２Ｇｌ Ｇ ） 准 品 ；ｉ ｌ ｉ 色 ； Ｔｓ Ｂ 、 、 和 ２标 Ｂ Ｓｍｐｉ － ｃ
ｔ ８ ｙ １５型纯 水机 制备 的超 纯水 。
１ ． 色谱 条 件 ２
免 疫 亲 和 柱净 化 一 柱后 光 化 学 衍 生 高效 液 相 色 谱 法 具 有 简 便 、 速 、 化效 果 好 的特 点 ， 近年 的文 献 中多 有 报 快 净 在
道 ． 目前 尚 未形 成 国标 方法 ， 于取 得认 证 资 格 的第 三 但 对 方 检 测 实 验 室 而 言 ， 在 本 实 验 室 采用 该 方 法 必 须 进 行 要 验 证 实验 。
免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素A的方法研究_张辉珍
2008, Vol. 29, No. 12食品科学※分析检测552免疫亲和层析净化高效液相色谱测定赭曲霉毒素Ａ的方法研究张辉珍２，马爱国１，＊，李惠颖２，王晓滨２（１．青岛大学医学院营养研究所，山东 青岛 ２６６０２１；２．青岛市产品质量监督检验所，山东 青岛 ２６６０６１）摘 要：试样经甲醇－水或碳酸氢钠－水溶液提取，提取液稀释过滤后经过含有赭曲霉毒Ａ特异性抗体的免疫亲和柱层析净化，洗脱液用Ｃ１８（１５０×４．６０ｍｍ，５μｍ）色谱柱分离，荧光检测器测定。
流动相为乙腈：水：乙酸为９９：９９：２；激发波长３３３ｎｍ；发射波长４７７ｎｍ；柱温３５℃；进样量１００μｌ；外标法定量，结果表明，色谱峰面积与含量之间有良好的线性关系，方法的检出限为０．２μｇ／ｋｇ，加标回收率为９０．３％～１０６％，对不同浓度的样品相对标准偏差ＲＳＤ为１．７５％～４．３２％。
该方法操作简便、准确，回收率高、精密度良好、重现性好，可用于谷物、酒类、调味料等产品中赭曲霉毒素Ａ的测定。
关键词：赭曲霉毒素Ａ；免疫亲和层析净化；高效液相色谱Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ ｉｎ Ｆｏｏｄｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｚｈｅｎ２，ＭＡ Ａｉ－ｇｕｏ１，＊，ＬＩ Ｈｕｉ－ｙｉｎｇ２，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｂｉｎ２（１．Ｉｎｓｔｉｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｑｉｎｇｄａｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０２１， Ｃｈｉｎａ；２．Ｑｉｎｇｄａｏ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｔｙ， Ｑｉｎｇｄａｏ ２６６０６１， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ （ＯＴＡ） ｉｎ ｆｏｏｄｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈａｎｏｌ－ ｗａｔｅｒ ｏｒ ＮａＨＣＯ３ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ａｆｔｅｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔａｒｃｔｓ， ｆｌｏｗｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＯｃｈｒａＴｅｓｔ ｃｏｌｕｍｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＯＴＡ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ， ＯＴＡ ｂｕｆｆｅｒ， ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ， ａｎｄ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｔｕｒｎ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈａｎｏｌｅｌｕａｔｅ ｗａｓ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｎ Ｃ１８ （１５０×４．６０ ｍｍ，５μｍ） ａｔ ３５ ℃ ｗｉｔｈ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ ｗａｔｅｒ－ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （９９：９９：２， Ｖ／Ｖ） ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅａｔ ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ０．９０ ｍｌ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｓ ３３３ ｎｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｗａｓ ４７７ ｎｍ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｅａｋ ａｒｅａ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ ｏｆＯＴＡ ａｒｅ ９０．３％ ｔｏ １０６％， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ａｒｅ１．７５％ ｔｏ ４．３２％ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｓａｍｐｌｅ． Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ， ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＴＡ ｉｎ ｆｏｏｄｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ；ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｌｅａｎ－ｕｐ；ＨＰＬＣ中图分类号：ＴＳ２０７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０５５２－０３收稿日期：２００７－１０－１９作者简介：张辉珍（１９６６－），女，高级工程师，博士研究生，研究方向为营养与食品安全。
免疫亲和柱在真菌毒素检测中的应用
烯酮与赭曲霉毒素 A4 种真菌毒素 [3]。 2.1 真菌毒素的来源
真菌毒素的来源大致分为 2 类： 作物收获前的真菌毒素污染，作物收 获后的真菌毒素污染 [4]。
2.1.1 收获前的真菌毒素来源渠道 任 何 在 生 长 阶 段 的 农 作 物， 包 括 饲草以及谷物等，在受到真菌污染时， 都极易产生真菌毒素。真菌在跟随农 作物由田间向饲料加工厂再到饲料槽 的这一流转过程中，不太可能会存活 下来，即使有少部分的真菌存活下来， 而在检测饲料的常见指标时，如果饲 料的原料成色以及外观看起来都很好， 那么这些看起来成色以及外观很好的 饲料原料就有可能成为真菌毒素的避 难所。 2.1.2 收获后的真菌毒素来源渠道 收 获 后 的 农 作 物， 如 果 其 储 存、 运输、加工的温度以及湿度条件满足 真菌生长的外部环境需求，那么真菌 就会继续生长，直至霉变产生真菌毒 素。如果粮食、饲料在收获储存过程中， 没有充分进行干燥处理，在储运过程 中温度和湿度过高，就会导致真菌迅 速生长，这时真菌毒素就会大量产生， 最终导致动物机体受到危害。 2.2 真菌毒素的特点
2.2.2 高稳定性 真 菌 毒 素 属 于 低 分 子 化 合 物， 其 结构十分稳定，耐高温。黄曲霉素的 化学性质十分稳定，即使是在 100℃ 的高温条件下储存 20h 也无法完全消 灭，需要温度达到 280℃的高温条件， 才能破坏其化学性质。 2.2.3 富集性 真菌毒素具备抗化学与物理试剂 的特点，可以在生物链中传播、富集。 在土壤中的真菌毒素会被谷物吸收， 从而引起真菌毒素污染问题。 2.2.4 特异性 真 菌 毒 素 的 分 子 结 构 不 同， 其 产 生的毒性差异十分大，比如黄曲霉毒 素就有 B1、B2、M1 与 M2 等结构类型， 它们的毒性各不相同。 2.2.5 相加性 2 种以上的真菌毒素混合在一起产 生的毒性远远大于单一毒素累加产生 的毒性，农作物大多是被几种真菌毒 素混合污染的，因此饲料中很有可能 同时存在几种真菌毒素。 2.2.6 污染地域性 动物饲料以及农作物中的真菌毒 素都有一定的地域性特点，比如，热 带和亚热带地区的真菌毒素大多都是 曲霉菌毒素，但是，由于贸易的全球 化发展，导致饲料农作物的真菌毒素 依然会在全球范围内传播。 2.2.7 隐蔽性 真菌毒素在检测时常会受到小分 子物质比如糖苷、葡糖苷酸、脂肪酸 酯和蛋白质等物质的覆盖，这些小分 子物质会与真菌毒素的分子结构融合 在一起，导致检测值显示阴性，真菌 毒素被掩盖，传统的检测分析方法是 无法检测出来的，但是这些与真菌毒 素所结合的小分子物质，会在人体消 化过程中被分解掉，从而将真菌毒素 释放出来，导致人体和动物的健康受
赭曲霉毒素免疫亲和柱操作说明书
百奥思科赭曲霉毒素A免疫亲和柱操作说明书【概要】赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉属和青霉属的真菌形成的次级代谢产物，属烈性的肾脏毒和肝脏毒，广泛存在于各种食物中，谷物及其副产品是赭曲霉毒素A的主要来源。
动物实验表明摄入了被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中毒症。
防止污染赭曲霉毒素A的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链，加强对赭曲霉毒素A的检测十分重要。
【适用范围及性能】本公司真菌毒素免疫柱系列产品测试形式是一个高性能的免疫亲和柱，设计用于在进行HPLC（高效液相色谱法）、GC-MS（气相色谱-质谱联用仪）、ELISA（酶联免疫吸附剂测定）之前清理（净化）或浓缩样本。
用于定性、定量检测谷物、酒类等食品和饲料等样本中的赭曲霉毒素A时的样品前处理。
柱容量：≥200ng回收率：≥90%【试验原理】本产品的测定的基础是抗原抗体反应，赭曲霉毒素A单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的赭曲霉毒素A经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过赭曲霉毒素A 免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，赭曲霉毒素A与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。
用甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到分析仪器中用于检测。
【包装组成】25支/盒，3mL柱管/支产品说明书1份【需要而未提供的设备及试剂】设备：┅┅高速均质器或组织匀浆机┅┅粉碎机┅┅200ml/50ml量筒┅┅天平：感量0.1g┅┅微量移液器：单道100μl～1000μl┅┅槽纹滤纸（折叠快速定性或定量滤纸）┅┅玻璃微纤维滤纸（1.5μm孔径）┅┅50ml漏斗┅┅一次性玻璃试管┅┅泵流操作架（包括空气泵，不同容积的玻璃注射器等）试剂：┅┅甲醇（色谱级）┅┅蒸馏水或去离子水┅┅pH7.0磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲液）：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL┅┅清洗缓冲液：25g 氯化钠+5g碳酸氢钠+0.1mL吐温-20 用纯水稀释至1000 mL【试剂配制】样品提取液：配制甲醇-水（8：2）溶液作为样品提取液【样本处理步骤】（一）花生，玉米，大米，小麦及其制品和饲料┅┅称取20g粉碎的样品于100mL容量瓶中，加入5.0g氯化钠，以甲醇-水（8：2）溶液定容；┅┅转移到均质杯中，以均质器高速搅拌，提取2分钟；┅┅4000r/min离心5min或用定量滤纸过滤；┅┅取10mL滤液并加入40mLPBS缓冲液稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，取过滤后液体待测；┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。
高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A
高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A摘要针对谷物及其制品可能污染的霉菌毒素——赭曲霉毒素A,用免疫亲和柱净化高效液相色谱法进行了验证。
关键词赭曲霉毒素A;高效液相色谱法;谷物及其制品;OchraTest免疫亲和柱赭曲霉毒素A是曲霉属和青霉属一些菌种的有毒产物,动物毒性试验表明,赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神经毒性、致畸性及致癌性。
1993年,国际癌症研究中心已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。
被赭曲霉毒素A污染的谷物及其制品是人体内赭曲霉毒素A的主要来源,通过对谷物及其制品中赭曲霉毒素A的检测可以估计人体每天摄入量。
目前国际上检测赭曲霉毒素A的方法有薄层层析法、酶联免疫吸附法及高效液相色谱法等,高效液相色谱法是最常用的方法。
本文验证了用高效液相色谱法测定谷物及其制品中赭曲霉毒素A含量的方法,现报告如下。
1材料与方法1.1试验原理将试样与提取溶液混合后高速均质、过滤得到提取液,提取液经稀释后加入到装有赭曲霉毒素A专一化抗体的免疫亲和柱中,使样品中的赭曲霉毒素A与抗体结合。
淋洗除杂质后,以甲醇洗脱溶液使赭曲霉毒素A与抗体分离洗脱,供液相色谱定性定量测定。
1.2材料与设备1.2.1材料。
色谱纯已腈、纯水、乙酸、磷酸盐缓冲液、色谱纯甲醇、折叠滤纸、微孔玻璃纤维滤纸、赭曲霉毒素A标准品。
1.2.2设备。
OchraTest免疫亲和柱,Agilent1100液相色谱仪(带有荧光检测器),高速均质机,手动玻璃注射器泵流架,电子天平(感量1g),谷物粉碎机。
1.3样品测定方法1.3.1提取。
称取50g磨细的样品,置于搅拌杯中,加入100 mL乙腈水溶液(乙腈∶水=60∶40),盖上搅拌杯的盖子,高速搅拌1min,取下盖子,将提取物倒入槽纹滤纸上,滤液收集于干净的容器中。
1.3.2提取物的稀释。
移取10mL上步的滤液,置于干净的容器中,用40mL纯水将滤液稀释、混匀,将上步稀释液通过玻璃微纤维滤纸过滤器,滤液收集于玻璃注射器筒中。
全自动免疫亲和在线净化—高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A
霉毒素A的方法，增加了免疫亲和柱的使用次数，提 高了检测的自动化水平和检测效率，降低了检测成
本,以满足大规模样品准确定量的需求。
第34卷第6期 谢 刚等 全自动免疫亲和在线净化一高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A 115
1材料与方法
1.1仪器与 Spark通用全自动高效液相色谱，配RIDA®
常用的OTA检测方法主要有胶体金试纸条 法［一7］、酶联免疫法或免疫传感器⑹、生物传感器 法［］、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析 ［0］、液相色谱 法或液质联用法［1一15］等方法。薄层色谱法由于操 作复杂，目前应用较少。胶体金和酶联免疫方法用 于快速筛查。液质联用仪检测需要高端的质谱仪。 离线净化的普通高效液相色谱方法目前应用较多， 但存在净化过程操作繁琐、分析速度较慢等问题。
摘 要 建立了全自动免疫亲和在线净化-高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A( Ochtatoxin A,OTA)的方法。玉米、小麦样晶经乙睛-水(60：40，卩:卩)提取,3% Tween - 20 (m/卩)水溶液10倍稀释后， 用自动进样器注入RIDA® CREST在线固相萃取系统，经赭曲霉毒素A免疫亲和小柱净化后，以乙睛-2%乙 酸水(50：50,卩:卩)为流动相，流速为1.0 mL/min,C18色谱柱(150 mm X 3.5 mm ,3.5 "m)分离，荧光检测器测 定。根据3倍信噪比的峰响应值，确定赭曲霉毒素A的检出限为0.24 Rg/kg,在0.012 5 ~0.5^g/L范围内呈 线性相关,值为0.999 8；在玉米、小麦样晶中加标回收率为80. 1% -106.9%，变异系数为2.4% ~8.2% 0 本方法一次装柱可检测60个样—,24 h可检测100个样—，满足谷物中赭曲霉毒素A快速准确定量检测的 需要。
免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素等检测中的应用
➢操作步骤——
均质样品
• 盖上搅拌杯的盖 子，高速均质12 分钟
• 也可以置于锥形 瓶中，在摇床上 振动30分钟左右
粗滤与稀释
• 将均质液通过槽 纹滤纸过滤，准 确移取15毫升滤 液并加入30毫升 水稀释
• 将免疫亲和柱 连接于玻璃注 射器下，准确 移取15毫升样 品提取液注入 玻璃注射器中
免疫亲和柱技术及其在黄曲霉毒素检测中的应用
黄曲霉毒素
免疫亲和柱技术在黄曲霉毒素中的应用
•黄曲霉毒素
黄曲霉毒素(Aflatoxin，A)是黄曲霉和寄生曲霉所产生的一组结
构类似的有毒代谢产物，其基本结掏为二呋喃环和香豆素。现已
分离出 AFB 1 ，AFB 2 ， AFG 1 ， AFG 2 ， AFB 2a ， AFG 2a ， AFM 1， AFM 2，AFP 1 等 18 种之多，其中以 AFB 1 的毒性和致 检癌测性标准最：强我。国现对已食证品实中有的A1F7B种1衍的限生量物标．准 其（G中B最276重1-要20的05）包括是：B花1、生、B1、 玉G米1、、G花2生、油M及1等其5制种品，的 被AFWBH1O≤划20为μgⅠ/kgA；类大致米及癌其物他。食用黄油曲的霉AF污B 染1 ≤1范0μ围g/k：g；玉 粮米食、、豆谷类物、、发酵花食生品、的 粮AF食B 1饲≤5料μg、/kg植；物婴儿油代、乳辣品不椒得等检作出。物我。国也规定牛乳
2.3 抗体与基体偶联
基体在与抗体偶联之前，需要进行活化。一般是在基体骨架 上引入亲电基团，然后与间隔分子或抗体上的亲核基团共价结 合，需要说明的是在小配体的亲合色谱中，常在基体和配体之 间插入一个间隔臂，以减小空间位阻的影响。
常用的活化试剂包括溴化氰、环氧氯丙烷和维生素H酰肼等 抗体与活化基体的偶联方式有随机偶联与定向偶联两种。
高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A
Ｏ Ｔ Ａ ） 是其 中毒性最大 、 与人类健康关 系最密切 、 产 毒量最高 、 对农作物的污染最重 、 分布最广 的［ ２ ３ 。赭
曲霉毒 素 Ａ是 被 国际癌 症研 究机 构 确定 为 ⅡＢ类致 癌 物 的一 种真 菌 毒 素 ， 具有致癌 、 致畸、 肝 肾毒性 和
第 ３ ９卷 第 ４ 期 ２０１ ４ 年 ８ 月
Ｇｒ ａ ｉ ｎ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｉ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ ＇ Ｅ ｃ ｏ ｎ ｏ ｍｙ
粮食 舯 妓毒 任涛
Ｖ ｏ｝ ． ３９ ． Ｎｏ． ４
Ａｕｇ． ２０１ ４
［ 摘要 ］ 建立了一种使用岛津超高效液相 色谱仪 Ｌ Ｃ 一 ３ ０ Ａ测定粮食 中赭 曲霉毒素 Ａ的方法。 实验结果表 明：
在浓度范围 Ｏ ． ５ ５ ０ ｐ ， ｇ ／ Ｌ内 ， 校 准 曲线相 关 系数 大 于 ０ ． ９ ９ ９ ； 样量 ２ Ｌ， 仪 器检 出限为 ０ ． １ ５ Ｉ ｘ ｇ ／ Ｌ， 定 量 限 为 ０ ． ５ ｇ ， Ｌ 。３个 浓度 下标 准 品 的保 留 时 间和峰 面积 相 对标 准偏 差 分 别 在 ０ ． ０ ３ ％－ ０ ． ３ ｌ ％和 ０ ． ４ １ ％－ １ ． ９ １ ％； 玉
高效液相色谱法快速测定粮食 中赭 曲霉毒素 Ａ
王郑平 ， 郭 健 ， 曹 阳 ， 尚艳娥 ， 张 品 ， 李月琪
（ １ ． 国家粮 油质 量监督 检 验 中心 ， 北京 １ ０ ０ １ ６ ２ ； ２ 岛 津企业管理（ 中国） 有限公司分析仪器事业部分析中心 ， 北京 １ ０ ０ ０ ２ ０ ）
１ 材料与方法
１ ． １ 仪 器
高效液相色谱法测定酒中的赭曲霉毒素A
１ １ 试 剂 和 药 品 ．
赭 曲霉毒索包禽 Ａ、 、 Ｂ Ｃ等七种结构类 似的化合物 ， 中以赭 其 曲霉毒素 Ａ的毒性最大 ［ ， １ 主要对 肾产生危 害． ］ 造成 肾肿 大 ，
当浓 度 超 过 ５ ｇ ｋ 时 ， 对 肝 脏 组 织 和 肠 产 生 破 坏 ， 起 肠 ｍ／ｇ 会 引 炎、 肝肿 大 等 。 赭 曲霉 毒 索 能 引 起 肾脏 的严 重 病 变 、 脏 的 肝
收 率 为 ９ ．％ 一９ ．％ ， Ｓ ％ （１ ， 低 检 测 限 为 ００ ｎ／ Ｌ 线 性 范 围为 ０ １ ０ ｇｍ 。 ２８ ９５ ＲＤ ０ 最 ．４ｇｍ ， ． —１ｎ／ Ｌ
关键词 ： 赭曲霉毒素 Ａ； 酒类 ； 免疫 亲和柱 ； 高效液相 色谱
中 圈 分类 号 ：Ｓ６ ； ２７ ３０ ５ ． ； ９６２ Ｔ ２ ２ ０ ．：６ ７７ Ｒ ９ ． ２
［４ 敬 军 编 ． 品分 析 实 验 ［ ． 品 科 技 系 食 品 化 学 教 研 室 ．５ １］潭 食 Ｍ］ 食 ２
—
［ ］ １ 张惟杰主编 ． ６ 复合多糖生 化研究技 术 ［ ． Ｍ］ 上海 ： 上海 科学 技术
出版 社 ，９ ７ １． １８ ：３ ［７ 徐 １］ 跃 ， 才锦 ， 于 慧 编 译 ．真 菌 ａ 张 张 一淀 粉 酶 的 性 质 、 产 和 应 生
高效 液 相 色 谱 法 测 定 酒 中的赭 曲霉 毒素 Ａ
许 焯 马荣 山 ， ， 李 军
ｌ ０１ １ ０） ６ （ 沈 阳农业 大学。 阳 ｌ １ １ ２辽宁出入境检验检疫局 ． １ 沈 １ ６； ０ 大连
摘 要 ： 究 了单克隆免疫亲和柱 一高效液相 色谱 法测定 酒 中赭 曲霉毒 素 Ａ的方法。脱 气后 的酒类样 品用 研
免疫亲和柱-高效液相色谱法测定饼干中赭曲霉毒素A
关键词：高效液相色谱柱；免疫亲和柱；赭曲霉毒素 A
赭曲霉毒素是一组结构类似的真菌毒素，有 A、B、C、 D 4 种化合物，主要危及人和动物肾脏，其中毒性最大、与 人类健康关系最密切、产毒量最高、对农作物的污染最重及 分布最广的是赭曲霉毒素 A[1]。赭曲霉毒素 A 致癌、致畸、 破坏免疫系统，对肝、肾脏造成损害，还可以导致神经中毒 [2]。
线性方程为 y=9 915.48x+1 391.31，以信噪比为 S/N ≥ 10 时确
定定量限为 1.0 μg/kg，欧盟规定饼干中赭曲霉毒素 A 限量值
为 3.0 μg/kg，方法定量限满足检测的需求。
为了保障人民的身体健康，《食品安全国家标准 食品中真
菌毒素限量》（GB 2761—2017）规定了谷物及其制品（不包 括焙烤食品）中赭曲霉毒素 A 的限量为 5.0 μg/kg[3]。
2021 年 4 月，瑞典通过欧盟食品和饲料快速预警系统 通报出口至我国的薄脆饼干中赭曲霉毒素 A 含量不合格， 目前文献报道的赭曲霉毒素 A 的方法主要涉及粮食及其制 品、咖啡、酒 [4-6]，针对饼干中赭曲霉毒素 A 测定技术的研 究较少。因此有必要建立饼干中赭曲霉毒素 A 的检测方法， 为开展饼干中赭曲霉毒素 A 的风险监测提供技术支撑。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂
免疫亲和柱净化一光化学柱后衍生高效液相色谱荧光法测定粮食中黄曲霉毒素
摘 要 ： 立 了粮 食 中黄 曲 霉毒 素 Ｂ 、 Ｇ 、 的免 疫 亲和 柱 净 化一 化 学柱 后 衍 生 高效 液 相 色谱 荧光 检 测 法 。 建 Ｂ 、 Ｇ 光 样 品 经 甲 醇一 水提 取 ， 疫 亲和 柱 净 化 ， 免 高效 液相 色谱 分 离 ， 化 学柱 后 衍 生 ， 光 荧光 检 测 器测 定 。 结 果表 明 ， 曲 霉 黄 毒 素 Ｂ 、 Ｇ 、 的检 出 限分 别 为 ０ ５ 、． ５ ０ ５ 、．５￣ ／ ｇ 回 收 率 为 ６ ． ～９ ． ， Ｄ 小 于 １ 。该 Ｂ 、 Ｇ ． Ｏ０ ２ 、． ０ ０２ ｇｋ ， ７２ １７ ＲＳ Ｏ 方 法 快速 、 准确 、 敏 度 高 、 现 性好 ， 满足 我 国对 粮 食 中黄 曲 霉毒 素 限量 的 检 测 要 求 。 灵 重 能 关 键 词 ： 疫 亲 和柱 ； 后 衍 生 ； 曲 霉毒 素 ； 免 柱 黄 高效 液 相 色谱 ； 食 ｈ ｍｉ ａ ｅ ｉ ａ ｉ ｎ
Ｆａ ｎ Ｚｈａ ｕ， ｅ ｕ ｈ ｎｇ ｎｇ Ｆａ ｇ， ｎｇ Ｘ Ｚｈ ｎｇ Ｒ ｉ ａ
（ ｚ ｏ ｕ ｉｉａ ａｉ ｎ ｃ ｎｃ ｌ ｕ ｅ ｖｓ ｎ ａ ｄＴｅｔｎ ｎ ｅ ， ｚ ｏ ２ ０ ４， ｉａ Ｑｕ ｈ ｕＭ ｎｃｐ ｌ Ｑｕ ｌ ｙ ａ ｄ Ｔｅ ｈ ｉａ ｐ ｒ ｉｉ ｎ ｓｉｇ Ｃｅ ｔｒ Ｑｕ ｈ ｕ ３ ４ ０ Ｃｈｎ ） ｔ Ｓ ｏ ＡＢ ＴＲＡＣ Ａ ｔｏ ｏ ｅｅｍｉａｉｎｏ ｆ ｔｘｎＢ ，１ ，Ｇ１ａ ｄＧ２ｂ Ｓ Ｔ： ｍｅｈ ｄ ｆｒｄｔｒ ｎ ｔ ｆ ｌ ｏ ｉ ｏ ａａ ３ ２ ｎ ｙｉ ｍｍｕ ｅａｆ ｉ ｏｕ ｌ ｎｕ ｎ Ｌ ｔ ｏ ｔ ｏ— ｎ －ｆ ｎｔ ｃｌｍｎｃｅ － ｐａ ｄＨＰ Ｃ ｗｉ ｐ ｓ ｌ ｉ ｙ ａ ｈ ｃ
免疫学法检测赭曲霉毒素A研究进展
Ｋｅ ｒ ：ｏ ｈ ａ ｏ ｉ ；ｆｕｏ ｅ ｃ ｎ ｅ；ｉ ｙ ｗｏ ｄｓ ｃ ｒ ｔ ｘ ｎ Ａ ｌ ｒ ｓｅ ｃ ｍ ｎ ｃ ｅ ｃ ｌ ａ ｙ ｉ ｕ ｏ ｈ ｍ ｉａ ｎ ｌ ｓｓ ａ
中图分 类号 ： Ｓ ０ ． Ｔ ２ ７４
文献标 识码 ： Ａ
文章 编号 ：１０ —９ ７ ２ １ ） １ ０ ３ ～ ０ ０ ８ ５ ８（ ０ ０ ０ — ０ ３ ３
２Ｏ Ａ免疫学检测方法 Ｔ 免 疫化学 分 析法是 以抗 原抗 体免 疫化 学反 应为 基础 进 行抗原 抗体 含量测 定方 法， 具有 高度特 异性、 灵敏性 和快速简便 等优点 。用 于 Ｏ Ａ检测免 疫学方 Ｔ 法主要 有免疫亲合柱 一荧光光 度法、 免疫亲和柱 一高 效 液 相 色 谱 法（Ａ － Ｐ Ｃ）酶 联 免 疫 法 （ Ｌ Ｓ 、 ＩＣ Ｈ Ｌ 、 Ｅ ＩＡ） 时 间分辨 荧光 免疫 法 （ Ｒ ＦＡ）胶 体金免 疫层 析技 Ｔ ＿Ｉ 、 术（ Ｉ Ｆ 和免疫传感器法等 。 Ｄ Ｇ Ａ）
２１ ０ ０年第 １ 期
粮 食 与 油 脂
３ ３
免 疫 学 法 检 测 赭 曲 霉 毒 素 Ａ 研 究 进 展
（． １ 西南大 学食 品科 学学 院 ， 重庆 市特 色食 品 工程技 术研 究 中心 ， 重 庆
４０１ ０ ７６）
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｏｃ ｒ ｔ ｘ ｎ Ａ ｓ ａ ｓ ｃ ｎ ａ ｙ ｍｅ ａ ｏ ｉ ｒ ｄ ｃ ｄ ｂ ｏ ｅ ｆ ｎ ｕ ｆＡｓ ｅ ｇ ｌ ｓ ａ ｄ ｔａ ｔ ｈ ａ ｏ ｉ ｉ ｅ ｏ ｄ ｒ ｔ ｂ ｌ ｅ ｐ ｏ ｕ ｅ ｙ ｓ ｍ ｕ ｇ ｓ ｏ ｐ ｒ ｉ ｕ ｎ ｔ ｌ Ｐ ｎ ｃ ｌ ｕ ． ｔ ｓｃ ｏ ｅｙ ｒ ｌ ｔ ｄｔ ｕ ｎｈ ａｔ ｅ ａ ｓ ｆ ｔ ｒ ａ ｘ ｃｔ ｎ ｄ ａ ｅｏ ｏ ｌ ｔ ｎ ｅ ｉ ｉ ｉ ｍ Ｉ ｉ ｌ ｓ ｌ ｅａ ｅ ｈ ｍａ ｅ ｌ ｂ ｃ ｕ ｅ ｏ ｓｇ ｅ ｔ ｏ ｉｉ ａ ｄ ｗｉ ｅｒ ｇ ｆ ｌ ｉ ． ｌ ｏ ｈ ｉ ｔ ｙ ｐ ｕ ｏ Ｔｈ ｉ ｈ ｓ ｎ ｉ Ｖ ｔ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｄ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｃ ｔ ｘ ｎ Ａ ｓ ｂ ｓ ｄ ｏ ｔ ｗｎ ｆｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｅ ｈ ｇ — ｅ ｓ ｔ ｉ ｆ ｒ ｓ ｅ ｃ ｅ ｅ ｔ ｆｏ ｈ ａ ｏ ｉ ｗａ ａ ｅ ｎ ｉｓ ｏ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｉ ｙ ｕ ｏ ｒ ｃ ａ ａ ｔｒｓ ｉ ｓ ｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ｔ ．Ｗ ｈ ｌ ｔ ｓ ｅ ｓｌ ｎ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｙ ｏ ｈ ｒｓ ｂ ｔａ ｅ ｆｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｗｈ ｃ ｅ ｕ ｔ ｎ ｃ ｉ ｉ ｗａ ａ ｉ ｉ ｔｒ ｅ ｅ ｃ ｄ ｂ ｔ ｅ ｕ ｓｒ ｔ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ， ｉ ｈ ｒ ｓ ｌ ｉ ｅ ｙ ｌ ｓ ａ ｌ ｎ ｅ ｅ ｔ ｎ ｃ ｃ ｅ ａ ｄ ｈ ｇ ｏ ｔ Ｂｅ ａ ｓ ｆｉ ｉ ｈ ｓ ｅ ｉｉ ｉ ｏ ｇ ｄ ｔ ｃ ｉ ｙ ｌ ｎ ｉ ｈ ｃ ｓ． ｃ ｕ ｅ ｏ ｓ ｈ ｇ ｐ ｃｆｃ ｔ ｏ ｔ ｙ，ｓ ｎ ｉｉ ｉ ｎ ｏ ｖ ｎ ｅ ｃ ， ｅ ｓｔｖ ｔ ａ ｄ ｃ ｎ ｅ ｉｎ ｅ ｙ
免疫亲和柱净化快速测定油籽和食用植物油中赭曲霉毒素A
免疫亲和柱净化快速测定油籽和食用植物油中赭曲霉毒素A 褚庆华;郭德华;王敏;王雄
【期刊名称】《检验检疫学刊》
【年(卷),期】2004(014)003
【摘要】针对油籽和食用植物油中可能污染的霉菌毒素-赭曲霉毒素A采用免疫亲和柱净化手段,建立了快速筛选方法(荧光光度法)和确证方法(液相色谱法).本方法在1～50μg/kg添加范围内的回收率为64.7%～120%,符合SN/T0001-1995的规定,可以满足快速、准确检测的需要.
【总页数】3页(P45-47)
【作者】褚庆华;郭德华;王敏;王雄
【作者单位】上海检验检疫局;上海检验检疫局;上海检验检疫局;北京中检维康技术有限公司
【正文语种】中文
【中图分类】R1
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1.免疫亲和柱净化-高效液相色谱-三重串联四级杆质谱法测定食用植物油中的黄曲霉毒素B1 [J], 史俊文;刘凤芝
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中药中赭曲霉毒素A的检测方法研究
中药中赭曲霉毒素A的检测方法研究发表时间：2017-05-31T16:14:59.017Z 来源：《医药前沿》2017年5月第15期作者：季宜芳1 姚冬娟（通讯作者）2 [导读] 应用该检测方法测定中药材中赭曲霉毒素A含量，具有操作相对简单、结果准确可靠等优点，可推广使用。
（1江苏省如皋市人民医院门诊药房江苏如皋 226500）（2江苏省第二中医院药学部江苏南京 210000）【摘要】目的：探讨中药中赭曲霉毒素A(OTA)的有效检测方法。
方法：对部分中药饮片进行抽样、甲醇提取，再经免疫亲和柱滤过后应用高效液相一荧光检测法进行测定并统计分析检测结果。
结果：按拟定检测方法测定后表明，OTA标准样本及供试样本的质量浓度（0.5～20ng/ml）与色谱峰面积线性关系良好，且r大于0.9999；加样回收率为65%～108%，该方法的检出限为0.235ug/kg，定量限为2ug/kg。
结论：应用该检测方法测定中药材中赭曲霉毒素A含量，具有操作相对简单、结果准确可靠等优点，可推广使用。
【关键词】中药；赭曲霉毒素A；检测【中图分类号】R927.2 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2017）15-0353-01 在临床工作中，中药的疗效独特，副作用相对较小，目前已经受到了世界各国的高度重视与认可。
由于中药材在种植、采收及储存当中都有可能受到赭曲霉菌及其它真菌的污染而产生毒素，对药材质量及临床用药的安全性造成了极大影响[1]。
随着中药的应用越来越广泛，中药中OTA的实际含量问题的受关注程度也在不断的加大。
因而建立快速而有效的OTA检测方法，对保障药材质量及用药安全性有着积极促进作用[2]。
本研究将重点探讨中药材中OTA的有效检测方法；报告如下。
1.仪器与试药1.1 仪器高速均质器(德国IKA)；OTA免疫亲和柱(USA- VICAM)；USA-Agilent 1100高效液相色谱仪及荧光检测器，OTA标准样本(Sigma公司提供，批号：126K4026)，超声振动仪、天平秤、纯净水、80%甲醇、磷酸盐缓冲液。
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免疫亲和柱-高效液相色谱在白酒赭曲霉毒素A 检测中的应用孙林超(江苏食品职业技术学院，江苏淮安223003)摘要：将免疫亲和柱-高效液相色谱-荧光检测器相结合，测定白酒中赭曲霉毒素A 的含量。
建立了测定白酒中赭曲霉毒素A 的方法。
该方法用2%NaHCO 3和15%NaCl 的水溶液对白酒中赭曲霉毒素A 进行提取，然后通过OchraTest 免疫亲和柱净化，采用Agilent -C l8柱(4.6mm ×300mm ，5μm)，流动相为乙腈-水-乙酸(体积比为50∶49∶1)，流速0.80mL/min ，激发波长335nm ，发射波长465nm ，柱温30℃，进样量20μL 。
结果表明，赭曲霉毒素A 在1.0×10-9～10×10-9g/mL 时，浓度与峰面积呈线性关系(r=0.9981)，加标回收率为93.33%～97.40%，最低检出限为0.12×10-9g/mL ，相对标准偏差分别为2.16%、3.13%和5.19%。
关键词：检测方法；白酒；赭曲霉毒素A ；免疫亲合柱；高效液相色谱中图分类号：TS262.3；TS261.7；O657.72文献标识码：B文章编号：1001－9286（2009）03－0113－03Application of Immuno affinity Columns-HPLC Method in theDetermination of Ochratoxin A Content in LiquorSUN Lin-chao(Jiangsu Food Science College,Huaian,Jiangsu 223003,China)Abstract :Immuno affinity column combined with HPLC and fluorescence detector was used for the determination of ochratoxin A (OTA)con-tent in liquor.It was a newly-developed determination method.By this method,ochratoxin A in liquor was extracted by 2%NaHCO 3and 15%NaCl,then purified by Ochra Test immuno affinity column.The chromatographic conditions included Agilent-C l8column (4.6mm ×300mm,5μm)and the mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile,water and acetic acid by 50∶49∶1(v/v).The flow rate was 0.80mL/min.Exciting wavelengh was at 335nm and emission wavelengh was at 465nm.Column temperature was at 30℃.The sample dose was 20μL.The results showed that when OTA content was at 1.0×10-9g/mL to 10×10-9g/mL ,perfect linearity between concentration and peak area ratio was obtained (r =0.9981),the recovery rate was 93.33%to 97.40%,and the detection limit was 0.12×10-9g/mL,the relative standard deviation (RSD)was 2.16%、3.13%、5.19%respectively.Key words :determination methods;liquor;ochratoxin A;immuno affinity columns;HPLC收稿日期：2009－01－16作者简介：孙林超(1965-)，男，实验师，本科，主要从事食品检测技术等方面的研究。
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)简称OTA ，是曲霉属和青霉属的一些菌种的有毒代谢产物，属真菌毒素之一[1]。
赭曲霉毒素包含A 、B 、C 等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A 的毒性最大[2]。
赭曲霉毒素能引起肾脏的严重病变、肝脏的急性功能障碍[3]、脂肪变性、透明变性及局部性坏死[4]，而且还有致畸性、致突变性、免疫抑制和致癌性[5]。
赭曲霉毒素广泛的存在于谷类、大豆、绿豆、花生、香料、干果[6]、动物肾脏、血液、咖啡、牛奶、白酒、啤酒、葡萄酒、巧克力、奶制品和调味品中[7]。
目前，测定赭曲霉毒素方法有薄层色谱、微柱法和液相色谱法、加酶联免疫吸附法和放射免疫法[8]。
当今对于白酒中的赭曲霉毒素A 的研究很少。
免疫亲合柱是利用真菌毒素特异性抗体制成的一种净化柱，具有选择性高、特异性强[9]、快速和准确的特性。
样品提取液通过免疫亲和柱时，保证了真菌毒素与样品基质的有效分离，降低了检测方法的检出限，缩短了检测时间，减少了溶剂用量，精确度高，回收率高。
本文利用免疫亲和柱净化-高效液相色谱-荧光检测器相结合检测白酒中赭曲霉毒素A ，建立了一种简便、快速、灵敏、准确检测白酒中赭曲霉毒素A 的新方法。
1材料与方法1.1仪器与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪、荧光检测器、化学工作站；Agilent-C l8(4.6mm×300mm，5μm)；BS224S精密电子天平；GM-0.33隔膜真空泵；纯氮钢瓶；OchraTest免疫亲和柱(美国Vicam公司)；玻璃注射器；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；乙酸，色谱纯；赭曲霉毒素A标准品：纯度≥99%(美国sigma公司)，赭曲霉毒素A标准储备液(1μg/mL)，赭曲霉毒素A标准使用液(50ng/mL)。
1.2试验条件Agilent-C l8(4.6mm×300mm，5μm)；乙腈+水+乙酸(50+49+1)；流量为0.8mL/min；激发波长为335nm；发射波长为465nm；柱温30℃；进样量为20μL。
1.3样品处理1.3.1提取取10mL白酒样品加入10mL含有2%NaHCO3和15%NaCl的水溶液，混匀后用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液，浓缩至10mL。
1.3.2净化将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。
将上述提取滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以1滴/s流速缓慢通过免疫亲和柱。
直至2～3mL空气通过柱体。
以5mL含有2.5% NaCl和0.5%NaHCO3溶液淋洗柱子2次，再用10mL 蒸馏水以1～2滴/s的速度冲洗柱子，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过柱体。
准确加入2mL甲醇(色谱纯)洗脱，流速为1滴/s，收集洗脱液于具塞定量试管中，用氮气在50℃下吹干，然后用流动相定容至1mL，混匀，用0.45μm液膜过滤待用。
同时制备1份空白溶液。
1.4标准曲线的绘制精密吸取OTA标准使用液用流动相配制成浓度为0、1×10-9g/mL、2×10-9g/mL、4×10-9g/mL、6×10-9g/mL、8×10-9g/mL和10×10-9g/mL的OTA标准溶液。
按上述仪器条件进样20μL，测峰面积A绘制标准曲线。
在同样条件下，注入样品溶液20μL，测峰面积，由标准曲线计算OTA含量。
OTA浓度1×10-9～10×10-9g/mL范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为A= 136.21C+22.185，R=0.9981。
2结果与分析2.1标准品、样品、加标提取样品分析对标准品、样品、加标提取样品进行色谱分析，结果见图1和图2。
2.2免疫亲和柱的特性及柱容量免疫亲和柱是利用真菌毒素特异性抗体制成的一种净化柱，具有高选择性和抗干扰性。
免疫亲和柱中的抗体只有在一定的电解质强度、室温和pH中性条件下才具有理想的活性。
免疫亲和柱使提取液得到纯化，其选择性吸附的抗原物质是固定的，本试验采用不同含量的赭曲霉毒素A通过免疫亲和柱，结果见图3。
从图3可以看出，免疫亲和柱最大吸附容量约为160ng。
2.3流动相的选择在其他色谱条件不变情况下，分别用乙腈-水-乙酸、甲醇-水-乙酸、乙腈-磷酸钠溶液(0.012mol/L),1g/L 十六烷基三甲基溴酸铵、乙腈-异丙醇-乙酸、乙腈-乙酸、甲醇-磷酸、甲醇-乙酸作为流动相进行试验，试验表明，乙腈-水-乙酸(50+49+1)作为流动相，峰形良好，保留时间适中，与其他峰能够完全分离，没有拖尾现象。
乙酸的作用使提取液中OTA以钠盐的形式转化为OTA形式存在，消除OTA峰形拖尾。
图2加标提取样品色谱图图1标准品和样品色谱图图3免疫亲和柱的吸附容量2.4波长的选择用荧光分光光度计对浓度为6×10-9g/mL 的OTA 进行扫描，分别设定发射波长和激发波长：①发射波长为460nm ，激发波长在240～420nm 范围扫描；②激发波长为335nm ，发射波长在380～560nm 范围扫描，结果得出，最大激发波长为335nm ，发射波长为465nm 。
2.5提取液的选择分别用1%PEG +5%NaHCO 3、2%NaHCO 3+15%NaCl 、2.5%Na 2CO 3+1.5%NaCl 作为提取液进行试验，试验表明，2%NaHCO 3+15%NaCl 提取结果比较满意，回收率高。
提取液中NaCl 起到使溶液保持足够电解质强度的效果。
2.6淋洗液的选择分别用：①10mLPBS 溶液+0.1%吐温-20溶液冲洗，再用10mL 水洗；②10mL 2.5%NaCl +0.5%NaH-CO 3溶液冲洗，再用10mL 水洗；③10mL 2.5%NaCl +0.5%NaHCO 3+0.01%吐温-20溶液冲洗，再用10mL 水洗。
试验表明，2.5%NaCl +0.5%NaHCO 3溶液淋洗，净化效果较好，回收率较高。
2.7方法考察精确吸取高、中、低3种OTA 含量的样品溶液20μL ，各重复测定6次，结果见表1。
由表1可看出，方法有良好的重现性，重复6次测定的相对标准偏差RSD 分别为2.16%、3.13%和5.19%。
在样品液中加入一定浓度的OTA 标准溶液，测定样品的加标回收率，结果见表2。