论述植物制片技术
植物制片技术教学大纲
3.染色的方法
第三节封片（掌握）
1.封片法
本章重点、难点：
染色
本章教学要求：
掌握染色与封片
第六章显微摄影与图像分析
第一节切片材料的显微观察和注意事项（掌握）
第二节切片材料的测量方法（掌握）
第三节显微摄影时的注意事项（了解）
第一节图象的输出（掌握）
本章重点、难点：
材料的显微观察、测量
第三节透明（掌握）
1.透明的目的
2.透明剂及其透明法
第四节药品的回收与再用（了解）
1.包埋剂与包埋用具（了解）
2.石蜡渗透
第六节石蜡包埋（掌握）
1.包埋的操作过程
2.包埋中出现的问题及其解决办法
本章重点、难点：
石蜡包埋
本章教学要求：
掌握冲洗、脱水、透明与浸蜡、石蜡包埋方法
第四章切片、贴片与烘片
第一节切片（掌握）
三、学时分配
教学课时分配
章节
绪论
第一章
第二章
第三章
第四章
第五章
第六章章节内容
植物制片的基本原理与过程
手工制片、整体封片
材料的采集与分割取材、固定及试剂的配制
冲洗、脱水、透明与浸蜡
切片、贴片与烘片
染色与封片
显微摄影与图像分析
合计讲课111111
6实验0实践合计
四、教学内容及教学要求
绪论植物制片的基本原理植物制片的基本过程
第一章手工制片、整体封片
第一节手工制片的基本原理和过程（掌握）
第二节整体封片的基本原理和过程（掌握）
本章重点、难点：
手工制片、整体封片过程
本章教学要求：
掌握手工制片、整体封片方法
植物制片法
植物制片法一、徒手切片法及临时装片的制作徒手切片法不需要任何机械设备，只需要一把锋利的刀片，不但方法简单，而且也容易保持植物细胞的生活状态，所以有很大的实用价值。
1. 一般材料的切片方法和步骤进行切片前，准备一个盛有清水的培养皿，准备好毛笔、刀片等用具。
将要切的材料切成2-—3cm长的小段。
截取材料，削平切面，均应用解剖刀或用过的刀片。
而在作徒手切片时，再用锋利的新刀片，以保证切出合乎要求的切片。
作徒手切片时，最重要的是要切下一小片薄的组织。
例如切某植物茎的横切片时，不要求切下完整的一片，而只需切一小部分能够观察它的组织就行了，有时切的一边厚一边薄，取薄的一侧制成临时装片也有利于观察。
用左手大拇指、食指和中指捏住材料，拇指略低于中指，使材料突出于手指之上，这样以免损伤手指。
右手平稳地拿住刀片，将刀片平放在左手的食指之上，刀刃向内，且与材料断面平行，然后以均匀的力量，从左前方向右后方拉，材料要一次切下，切忌切片中途停顿或前后作“拉锯”式切割。
切片时要用臂力而不要用腕力，而且不要用力过大，也不能用刀片直接挤压材料，或从左右两方向来回切割材料，这样都不能切出合格切片。
切片时为了避免材料枯干，应使材料的切面及刀刃上保持有水，呈湿润状态。
薄的切片应该是透明的，切片可留在刀刃上继续切，一连切几个切片，然后用蘸水的毛笔把切片取下，放入盛有水的培养皿中，或直接选薄的放在滴有水滴的载玻片上，制成临时装片进行观察。
2. 柔软和坚硬材料的切片法过于柔软的器官，例如幼嫩的叶子，难于直接拿在手中进行切片。
切时需放在夹持物中，以便于把握操作。
夹持物一般用胡萝卜根、土豆块茎等，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。
对于较坚硬的材料，需要经过软化处理才能进行切片。
其软化方法通常是将要切的材料先切成小块，然后在开水中煮沸3—4小时，再浸入软化剂（50％酒精：甘油=1﹕1）中，一昼夜后或更长些时间后再切。
对于已经干燥或富含矿物质而更硬的材料，可先于15％氢氟酸的水溶液中浸渍数周后，使之充分浸透，再置入甘油中软化后方可进行切片。
植物显微
植物显微制片技术——石蜡切片一、原理：多数生物材料在自然状态下不适合显微观察，也无法看到其内部结构，因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构。
另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也难以辨明。
但在经过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋等程序后，就可把材料切成极薄而且连续的切片，可以较清楚地显现细胞、组织的细微结构。
若用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成分含量的变化，在显微镜下清楚看到其中不同区域的组分状态。
几个关键步骤的原理如下:1、固定，是指用物理或化学的方法，迅速杀死植物的细胞、组织，使其形态结构尽可能保持在接近其生活时的状态。
2、脱水，是用脱水剂逐步取代样品中水分的过程，因水与透明剂、包埋剂不相溶，所以不能直接进入透明和包埋，必须经过脱水，逐步、彻底除去样品中的水分才能进入透明、包埋。
3、透明，是材料经过乙醇脱水后，组织内部已经没有水分，但脱水剂乙醇不能与石蜡相溶，石蜡不能进入细胞或组织，还要经过一种既能与脱水剂混合又能溶解包埋剂的溶剂（本次实验用二甲苯）来处理，便于包埋剂浸入植物组织或封藏。
4、浸蜡，是将包埋剂石蜡逐步透入植物细胞核组织取代透明剂的过程，石蜡在液体状态下浸入到细胞，在熔点以下温度条件下凝固成固体，起支撑作用，使切片后的细胞和组织固定在原位。
二、材料和用具：1、生物材料：桉树茎2、药品：FAA固定液、各级浓度的酒精、1%番红、固绿、二甲苯、石蜡、加拿大树胶等3、实验用具：带橡皮塞的小瓶、染色缸、小坩埚、小木块、纸盒、载玻片、刀片、镊子等4、仪器：光学显微镜、烘箱、恒温箱、电炉、切片机、展片台等三、制作方法（流程）：取样、材料的选择与分割→固定（FAA固定液）→冲洗（70%酒精）、染色（番红）→脱水（各级乙醇，低浓度→高浓度）→透明（二甲苯，低浓度→高浓度）→浸蜡（低浓度→高浓度）→包埋→修块与固着→切片→展片、粘片、镜检、烘片→脱蜡→复水（各级乙醇，高浓度→低浓度）→复染（固绿）→脱水（各级乙醇，高浓度→低浓度）→透明→封片→观察、照相四、结果：见附图五、讨论：在上述主要环节中，每一步都必须仔细操作，任何一步出现问题，都会影响制片质量。
实验一 植物制片技术
实验一植物制片技术临时水封玻片一、实验材料生物材料。
洋葱鳞茎、番茄。
实验用具。
显微镜、镊子、解剖针、小块软布、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸。
实验药品。
蒸馏水、稀释碘酒。
二、制作临时装片的程序和步骤（1）擦载玻片。
用左手的拇指和食指捏信载玻片的边缘，右手用软布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好后放在干净处备用。
（2）擦盖玻片。
先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再将右手拇指和食指用软布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着软布慢慢地进行擦试。
（3）用吸管在载玻片中央滴一滴清水（或直接滴加稀释碘液用以染色）。
（4）a. 洋葱表皮细胞观察取一块洋葱磷叶，在其内面（凹面，无色）用刀片浅划出长2mm的正方形，用镊子从正方形的一角撕下一小块洋葱内表皮，把洋葱内表皮放在载玻片的水滴中展平。
b. 果肉离散细胞观察用解剖针挑取少许已红熟的番茄果肉（以临近果皮的为好），把它们放在载玻片上的水滴中，用解剖针将果肉细胞拨匀，分散得越开越好。
（5）右手持镊子，轻轻夹住盖玻片一角，使盖玻片的边缘与液滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上，避免气泡的产生。
（6）盖玻片下水太多，可用吸水纸从一侧吸去，水少也可从一侧加入。
2、染色（1）把一滴染液滴在盖玻片的一侧；（2）用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引使染液浸润整个标本；（3）使盖玻片下的标本均匀着色。
徒手切片一、实验材料生物材料。
芹菜幼茎；水花生幼茎和叶片；2cm×1cm×0.5cm的土豆（或胡萝卜块）。
实验用具。
显微镜；双面刀片；载、盖玻片；镊子；培养皿。
实验药品。
蒸馏水；0.1%番红水溶液；1%甘油水溶液。
二、实验步骤1. 取材。
选择发育正常，有代表性的幼茎或叶片，用刀片从植株上割下，立即进行切片或保存在水中以防萎蔫。
2. 切片。
取茎长约1-2cm（如果是叶片等较为柔软的材料用胡萝卜或土豆等作为支持物，叶片大小为1×1cm），以左手的拇指、食指和中指夹住材料（要求材料突出在指尖上面约2-3mm），用右手握住刀片，刀口向内，以均匀的动作做横切面切片（切片时刀口和材料表面都要经常湿水，使之滑润），多切，掌握技巧，切片放入培养皿清水中充分展开。
植物切片制作
植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分。
植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。
徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。
优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中，便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块，一般以长2~3cm，切片断面不超过3~5mm2为宜。
对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。
有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。
实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。
2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。
3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
4、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。
用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。
简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。
植物制片技术
二、杀死、固定、保存
✤固定液的选择 根据观察目的和对象，选择固 定剂。同时，要充分考虑植物 种类、不同器官的特性。
二、杀死、固定、保存
✤固定液的渗透力 1）选择固定剂时，要充分考虑 固定液的性质、浓度和温度对 渗透力的影响。 2）植物材料的大小和组织紧密 程度对渗透的影响。
二、杀死、固定、保存
一、选 材
• 叶的切取：横切面。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
二、杀死、固定、保存
杀死：迅速终结植物材料的生命。要 求越快越好，使用渗透力强的药剂。
固定：在杀死基础上，组织或细胞保 持生活的状态，并在以后制片的过程 中不发生变化。
放入冷水中，促进石蜡短时间内凝 固。 （3）过夜后，取出备用。
五、浸透和包埋
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
六、切片
（1）修块： 将包有材 料的蜡块 修成一个 上窄下宽 的台体。 粘在木块 上，即可 切片。
植物显微技术
绪论
一、什么是植物显微技术 用于观察研究植物内部精细结
构的技术方法，包括制片技术、 光学显微镜技术和显微摄影技术， 是一门建立在生物学、化学以及 物理等多门学科基础之上的综合 性技术性学科。
绪论
二、植物显微技术的任务和目的 根据材料的自然特性，观察
植物制片报告-李秋然
南京农业大学实验报告科目：植物制片技术指导老师：孙建云学院：生命科学学院学生：李秋然学号： 1138216石蜡制片法观察水生水花生茎、叶研究小结学院：生命科学学院班级：生物技术82班姓名：李秋然学号：11382161、实验材料：水生水花生、石蜡、刀片、白纸板、切片机、烘箱、酒精、二甲苯等实验器材2、实验方法：2.1 取材与固定分别取水生和旱生的水花生，用刀片切成长约为1-1.5cm小段，每一种取约5小段，注意材料不宜过大。
材料取下后立即投入固定液中，固定材料的瓶上必须贴标签，标明取材日期，材料名称，小组名称。
固定可保持细胞原有的结构，并使组织硬化，便于切片和染色。
本实验采用F.A.A固定液固定材料，F.A.A固定液是植物制片中一种良好的固定液和保存液，材料平常固定2-24小时，但在此液中长期保存也无妨，加入5mL甘油效果更好。
F.A.A固定液配方：福尔马林（38%）5mL 冰醋酸5mL 酒精(70%)90 mL但需注意：此固定液中含有酒精，易使原生质发生收缩现象，所以细胞学制片和固定单细胞生物、丝状藻类以及菌类，一般采用其它的专用固定剂。
如果是幼嫩的叶片则使用50%的酒精进行配制。
2.2脱水与透明脱水是用脱水剂渗入植物细胞、组织中，使得细胞组织中原来的水分脱除干净，以便后继药物能更替进入其内。
通过脱水，使材料适当硬化，以利于切片。
本实验采用浓度逐级升高的酒精作为脱水剂，各级酒精脱水时间一般为2h，纯酒精要置换两次，但总的放置时间不能太长，以免材料变脆，步骤如下：30% 50% 70% 85% 95% 100% 100% 材料经脱水后，必须用透明剂取代植物组织中的酒精，以便石蜡渗入其中。
本实验采用二甲苯和酒精为透明剂，逐级升高二甲苯的浓度，每级透明时间一般为2h，二甲苯的穿透力较强，不宜在其中放置过久，步骤如下：1/2酒精+1/2二甲苯1/4 酒精+3/4二甲苯纯二甲苯纯二甲苯2.3浸蜡与包埋浸蜡过程是用石蜡进一步取代植物细胞组织中的二甲苯，使石蜡充分渗入植物组织中的各个部分。
植物石蜡切片法显微制片技术
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置
对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶
片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意 刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄 蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时， 需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植 物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）； 对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率 较低。
（五）脱水
• 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分 解。而且透明剂与水是不相混合的，不利 于材料的透明和包埋等后期处理。因此需 用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让 石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关 键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能 与其他有机溶剂互相替代。
• 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止 吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水 剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。
• 浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。
• 每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。
（八）包埋
• 材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡 块，以备切片。
• 操作方法：根据切片材料大小，确定所 需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先 叠好纸盒。
（九）切片
• 即（二）固定
• 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固 定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止， 并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变 化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折 光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新 鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、 大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上 标签。
植物切片制作
植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分。
植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。
徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。
优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中，便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块，一般以长2~3cm，切片断面不超过3~5mm2为宜。
对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。
有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。
实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。
2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。
3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
4、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。
用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。
简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
细胞核染料（碱性染料）： 苏木精，亚甲蓝，中性红，碱性品红，洋 红，地衣红，结晶紫，番红，甲苯绿，碱 蓝。 细胞质染料（酸性染料）： 酸性品红，亮绿，苯胺蓝，固绿，刚果红， 橘红G，曙红，贾纳斯绿，孔雀绿，甲基橙。
植物制片的一般原理
3. 染色方法
⑴死细胞染色。 ⑵活细胞染色。 选无毒性染料。 观察细胞质流、精子或流动孢子等。
植物制片的一般原理
5. 封边剂
石蜡，油漆，指甲油。
植物制片的一般原理
四、染色 一般做成永久切片观察的材料， 都需要染色。
植物制片的一般原理
1. 染色原理
很复杂，难以解释。 ⑴物理学的解释 ①毛细作用或渗透作用而进入组织的内部——因 为组织材料有孔隙。 ②电子吸附作用——因而染色牢度有强有弱。 ⑵化学上的解释 组织或细胞中的各部分，或是酸性的（结合阳离 子，即碱性染料），或是碱性的（结合阴离子， 即酸性染料）。但没有新物质形成。
植物制片的一般原理
⑶醋酸（乙酸，CH3COOH） 单独使用，浓度为0.3－5%。 特点：渗透力大，固定十分迅速，但易使 细胞发生膨胀。 常与甲醛（易引起收缩）混合使用。
植物制片的一般原理
⑷锇酸（OsO4） 四氧化锇，灰黄色结晶，中性，昂贵——白金。 使用浓度为1－2%。 强氧化剂，配制水要超净，不宜与还原性固定剂 配合。 特点： ①最好的固定剂，对细微结构的固定良好，是脂 肪性物质唯一的固定剂。
植物制片的一般原理
④不改变原生质原来的体积（膨胀或缩 小）； ⑤增加细胞内含物折光程度，易于鉴别； ⑥可增加媒染作用和染色能力； ⑦又能有保存作用。 单一的化学药品难以具备以上所有条件； 而几种药品混合，可成近似理想的混合固 定剂。
植物制片的一般原理
徒手切片技术
植物病理徒手制片技术徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。
限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。
(一)整体封藏法对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。
常用方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辨不清。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。
刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原体蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。
浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。
如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。
(二)徒手切片法欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
植物解剖与制片技术
植物解剖与制片技术一实验目的1. 掌握石蜡制片的基本原理和方法二、实验器具与试剂1．器具石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。
2．试剂10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、85%、70%）、二甲苯、蒸馏水、明胶、中性树胶等。
三、实验材料幼嫩薄荷的茎和叶四实验步骤１．将薄荷的茎和叶切至适宜大小，于FAA固定液保存24h以上。
２．将材料取出，用70%酒精冲洗三次，每次2h，70%酒精保存过夜。
３．脱水：将材料依次经过85%、95%、100%、100%酒精脱水，每次脱水时间为2h。
４．透明：将脱水后的材料用二甲苯进行透明。
具体步骤为：1/2纯酒精+1/2二甲苯（加入少许番红干粉使材料着色）✂纯二甲苯✂纯二甲苯，每级溶液中停留2小时。
５．低温渗蜡：将已透明好的材料加入熔化的石蜡与二甲苯（1：3）的混合液中，于40℃的温箱中保温，然后在慢慢加入碎石蜡至饱和，保温12h。
６．高温渗蜡：将温度逐步升至56℃，保温2h，将此石蜡与二甲苯的混合液换为熔化的纯石蜡，2小时后再换至新的纯石蜡中，3小时后进行包埋。
７．切片：将包埋好的材料修成小蜡块，切成10-15µm厚的蜡带，挑取较好的蜡带用明胶黏在载玻片上，与展片台上展片、烘干。
８．脱蜡、染色：具体步骤为：粘有材料的载玻片放入纯二甲苯（10min）✂纯二甲苯（10min）✂1/2纯酒精+1/2二甲苯（10min）✂100%酒精（5min）✂95%酒精（5min）✂85%酒精（5min）✂70%酒精（5min）✂番红（过夜）✂85%酒精（5min）✂95%酒精（5min）✂固绿（30s内）✂95%酒精（2min）✂100%酒精（5min）✂1/2纯酒精+1/2二甲苯（5min）✂纯二甲苯（5min）✂纯二甲苯（5min）✂封片９.观察、拍照五．实验结果图3 图4图1、2为薄荷茎，放大倍数分别为200×、400×；图3、4为薄荷叶，放大倍数分别为200×、200×。
制片技术在植物科学研究中应用
制片技术在植物科学研究中的应用摘要：植物制片技术是组织学，胚胎学，生理学以及细胞学等学科研究观察细胞，组织的生理病理形态变化的一种主要方法。
经过制片就可以在显微镜下清楚地看到生物材料不同区域组分状态，切片也便于保存。
植物制片技术分为非切片法和切片法两类。
植物制片技术是生物学中的基本技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验。
本文介绍几种制片方法、注意事项，以及应用。
关键词：石蜡切片显微结构超薄切片电子显微镜胚胎学正文：21世纪是生物科学的时代，我们研究生物就要观察生物的结构。
而一般生物体较大且不透明，不能直接在显微镜下观察。
要研究生物体的细微结构，一定要经过特殊的处理，使材料可以被观察认知。
无疑减少厚度及体积，使光线透过样品进行显微观察是其中方法之一。
这要求处理后的材料小而薄、完整、透明、保持原结构，具有颜色容易辨认等特点。
另外电镜的发明使我们对生物的进一步认识有了变化，他让我们了解的更多，当然我们需要完全不同于普通显微制片的要求。
也就是说为了利用不同的手段对生物进行研究我们需要采取不同的制片方法。
植物制片技术是植物显微技术的一个重要组成部分，本文将探讨制片技术在植物科学研究中的应用。
在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类。
一，切片法切片法顾名思义就是要对植物进行切割处理，一般有徒手切片法、石蜡切片法、半薄切片法、冰冻切片法、振动切片法、滑走切片法、超薄切片法等。
这里仅以几个为例:1、徒手切片法：徒手切片法是指手持刀片将新鲜的或固定的实验材料切成薄片的制作方法，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，也可以通过脱水与染色制成永久制片。
染色体技术之制片技术的原理
三、比较：
植物染色体标本的制备最常用的方法是压片法， 但压片法的不足是由于细胞堆积致使染色体很难彻 底分散开。 而去壁低渗火焰干燥法则有效地克服了压片法 中存在的染色体分散不开，平展不开等不足，现已 广泛用于核型分析，染色体显带
原理：
有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物的根 尖或茎尖的分生组织中。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有 较大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是 有规律的进行。 各种生物染色体在数目和形态上是相对恒定的，并随科属 种的不同而具有一定的特征。 人们若需了解某一物种的染色体数目，最有效的方法就是 观察有丝分裂的中期，这样可以得到较为准确的结果。
二、去壁低渗干燥火焰法
原理：
植物细胞有很坚实的细胞壁，染色体很难像动物染色体 那样平整地贴在载玻片上，可通过纤维素酶和果胶酶处理去 掉细胞壁；用低渗溶液处理可以提高染色体的分散程度。 去壁低渗干燥火焰法是：先用纤维素酶和果胶酶去除细胞 壁，得到原生质体，再将细胞进行低渗处理，即把细胞置于 低渗液（低浓度的kcl或蒸馏水）中，使细胞充分吸胀,染色 体分散，平展地铺在载玻片上，再用火焰干燥让染色体紧贴 在载玻片上。
植物制片的一般原理与方法
植物制片的一般原理与方法第一章植物制片的方法及预备植物制片技术是植物显微技术课的一个重要组成部分，在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的讨论和教学工作中，都需要应用显微制片技术，由于各种作物器官的性质差异以及讨论目的的不同，就需要不同的制片方法，但因限于学时及篇幅，本书仅依据常用的基本原理及教学中行之有效的方法加以介绍。
第一节植物制片的基本要求与主要制片方法植物内部结构不能用大而厚的组织块置于显微镜下观看，必需进行制作切片，才能供显微镜下观看应用。
石蜡（或徒手）切片，是将植物切成薄的材料，按下列主要步骤与要求制成永存切片。
1.采样：材料的选择与分割2.杀生、固定与器皿清洗3.冲洗（有的不经此步）4.脱水（各级酒精）5.透亮6.渗透（例如浸蜡）7.包埋（石蜡包埋）8.切片（切片机或徒手切片）9.粘片10.烘片11.脱包埋剂（石蜡）12.经各级酒精（脱水）13.染色14.分色15.脱水16.透亮17.封藏成永存片从上述主要环节来看，首先将材料加以处理（1、2、3项），其次步进行制片基础的处理工作（4、5、6、7项），在保证质量完成这两类工作基础上，方可顺当完成切片工作（包括8、9、10项），也就是说切出符合规格的薄片来，然后再对组织进行染色、脱水、透亮等一系列工作，才可制成透亮清楚、染色艳丽、适合显微镜观看摄影，并作教学、科研长期保存的永存片。
其具体制片过程与方法，在以后章节内加以介绍。
通常制片分两大类型。
其次节溶液的配制（一）各级酒精浓度的配制在植物制片中常用各级酒精，一般以95%酒精来配制，为节省起见，避开用无水酒精来配制各级酒精（表1一2）。
在试验中使用酒精量较大，每次以量筒量液花费时间多，可在500ml细口瓶有玻璃塞的瓶上贴一条宽1cm与瓶等长的白色纸条，仅在第一次用量筒量酒精与蒸馆水的用量处划上刻度，以后每当瓶内溶液用完，即以纸条上刻度分别倒入酒精和蒸馆水的各用量即可。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法
植物制片的染色及显微化学鉴定方法植物制片是植物解剖学研究的基础，主要包括了样品的采集、处理、包埋和切片等步骤。
制片的质量直接影响着后续染色和显微化学鉴定结果的准确性和可靠性。
以下是植物制片的一般步骤：1.采集样品：根据研究需要，采集符合实验要求的植物部件，如叶片、茎、花粉等。
2.处理样品：对采集到的植物样品进行初步处理，如去除杂质、保持新鲜等。
3.包埋样品：将处理后的样品进行包埋，使用适宜的包埋剂，如石腊、低熔点石蜡等。
4. 切片样品：将包埋好的样品进行切片，使用微tome等工具进行切割，制备出适当厚度的切片。
一旦制片完成后，接下来需要进行染色和显微化学鉴定。
染色方法可以增强显微镜下的观察效果，常见的染色方法包括常规染色和特殊染色。
1.常规染色方法：最常用的染色方法是使用苏丹精、碘红等生物染料，用于染色细胞壁、细胞核等常见组织结构。
常规染色方法可以提供植物组织的基本信息。
2.特殊染色方法：特殊染色方法主要用于特定的组织结构或化学物质的染色。
如使用苏木精-伊红染色对木质部和木质纤维进行染色，使用布氏染色对淀粉进行染色等。
显微化学鉴定方法是通过对制片样品进行特定试剂处理，以便于观察和检测特定化学物质的存在与否。
常用的显微化学鉴定方法包括：1.反应性染色：使用生化试剂或化学试剂与组织中的化学物质进行反应，产生特定的颜色或沉淀。
如使用碘酸钾溶液对淀粉进行碘反应形成蓝色物质。
2.酶反应：通过加入适当的酶试剂，使显色底物发生氧化还原反应，形成显色产物。
如使用过氧化氢试剂对过氧化物酶进行酶反应产生氧气和水。
3.化学反应：使用特定化学试剂，对特定化学物质进行识别。
如使用铁氰化钾试剂对根际紧矿质进行化学反应，生成蓝色的沉淀。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法，通过染色和试剂处理等手段，可以使植物组织结构变得更加清晰和可见，从而更好地研究和识别植物的组织结构、化学成分和功能。
这些方法对于植物科学研究和植物学教学有着重要价值。
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论述植物制片技术
摘要：
植物制片技术是组织学，胚胎学，生理学以及细胞学等学科研究观察细胞，组织的生理病理形态变化的一种主要方法。
经过制片就可以在显微镜下清楚地看到生物材料不同区域组分状态，切片也便于保存。
植物制片技术分为非切片法和切片法两类。
植物制片技术是生物学中的基本技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细致，不断总结经验。
本文介绍几种制片方法及其注意事项。
正文：
这学期我们学习了生物显微技术，了解了显微镜发展历史、种类、结构特点和应用范围以及植物制片技术。
而植物制片技术是植物显微技术的一个重要组成部分。
在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,滑走切片法，冰冻切片法, 石蜡切片法，火棉胶切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括压片法，整体封藏法,涂布法等.
1、徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，也可以通过脱水与染色制成永久制片。
徒手切片的优点是简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
要点：实验材料软硬适中，便于手持。
用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面，以免切伤手指。
右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。
用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用滴管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意：在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
切片时，两只手应该保持活动状态，，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
动作要敏捷，材料要一次切下，。
2、滑走切片法是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料。
此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。
滑走切片机由机身、升降夹物装置、切片刀的夹刀滑行部分等组成。
先把切片刀固定在夹刀上，然后将材料固定在切片机的夹物装置上。
调好材料的高度，使刀刃靠近材料的切面，并使材料与刀刃尽力平行。
用毛笔将材料沾湿。
切片时用左手扶切片刀的夹刀滑行部分，均匀用力往自己方向移动，刚开始由于材料平面不均匀，所以要多切几次直到得到较完整的切面。
将刀片擦干净，再次沾湿材料。
转柄转一圈，向内推动刀片，切片便被切下并粘在刀的表面上。
用湿毛笔把切片取下，放入盛水的培养皿里，然后把刀推回。
当把刀向后推时，再次转动转柄。
如此循环往复。
可将切片制成临时装片或进行简单的显微化学染色后观察，也可以通过固定、脱水、染色和封固等程序，制成永久制片。
注意每次用完滑走切片机要将刀片保护装置推上以免锋利的刀片刮伤人
3、石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。
它的操作程序包括：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、粘片、染色和封片。
它的优点是能够切出薄而均匀的连续切片。
4、涂片和压片是进行植物染色体观察研究常用的制片方法。
其中涂片是将新鲜的材料或者是经过固定的材料于载片上，托涂成均匀一层，经染色后盖上盖玻片镜检。
压片法是植物的器官或组织未经处理或经过处理后，被涂抹或压在载玻片上，使细胞成一薄层，便于进行观察的一种制片方法。
压片法的实验步骤包括：取材、预处理、固定、解离、染色、压片、镜检和制成永久制片等。
近年来植物制片的新技术：激光显微切割技术。
用于激光显微切割的植物组织制片技术也进行了改进。
切片方法的选择与优化：一般显微切割技术的样品采用快速的冰冻制片法。
该方法整个过程简便、耗时短,只需将组织用固定液固定之后再用包埋剂包埋,最后在冰冻切片机上完成切片。
激光显微切割技术切割动物组织时优先选用冰冻制片法。
但是冰冻切片法也存在一些缺点,如频繁的冷冻会使组织内产生大的冰晶从而破坏了组织学特征,增加了形态辨认的难度。
植物样品比动物样品的含水量要大得多,成熟的植物细胞中央大液泡可占据细胞体积的90 %以上, 其中的水分在样品的冷冻过程中极易形成冰晶,从而破坏细胞结构。
因此常规冰冻切片法容易造成植物切片卷曲或断裂及细胞破碎等问题。
若对常规冰冻制片方法加以改进,使组织在制片过程中保持完好,则冰冻制片法就可以适合植物切片。
如快速冷冻法能使水分在毫秒或者更短的时间内结晶,由于结晶的过程非常迅速, 致使细胞内外的介质变得更为黏稠, 无法形成较大的冰晶, 因而植物样品能保持良好的形态结构。
另外,还可以采用添加冷冻保护剂的方法。
冷冻保护剂的作用机理是保护剂与组织细胞中的水分结合, 降低细胞内溶液的冰点, 使形成冰晶或较大冰晶的机会减小,从而减轻细胞内冰晶对细胞及其组分的损伤。
另一种制片方法是石蜡制切片法。
虽然石蜡切片能保存完好的组织形态学特征,但是固定液可能会改变大分子的结构从而影响它们的完整性和可提取性。
实验表明,加入沉淀类固定剂可以改善石蜡切片的性能。
目前用于激光显微切割的植物组织制片方法在不断改进和创新以适应激光显微切割技术的应用。
有时植物制片过程会比较繁琐，周期长，所以开始制作之前要做好充分的计划和准备工作。
制作中药有足够的耐心，细致的完成每一步骤，因为每一个细节都可能影响到最终结果。
足够认真，多多练习并不断吸取教训总结经验就会得到满意的结果。
除此以外，创新也是很有必要的，不断地推陈出新植物制片技术才会不断完善。
参考文献：
1、陆叶,席梦利,刘光欣,徐进,施季森，激光显微切割技术在植物细胞和分子生物学研究中的应用进展（J），南京林业大学学报，2007， 31（2 ）：113-117
2、石蜡切片法的详细过程和注意事项（OL）,soso问问，2009-09-15
3、园艺植物制片方法（OL），生物在线，2007-3-23
4、河北大学细胞生物学实验室，显微标本制片技术（OL），百度文库，2010-04-07。