植物制片法
实验二植物染色体制片及有丝分裂观察
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ遗传学实验
植物染色体制片及有丝分裂观察
实验目的：
① 学习并掌握植物染色体玻片标本的制作方法; ② 观察植物细胞有丝分裂过程及各个时期的染色 体行为；
预习要求
实验目的
• 学习并掌握植物染色体玻片标 本的制作方法;
预习要求
流程: 材料要求,取材方法,实验 流程和各操作步骤实施原因 发根→预处理→固定→解离→ 低渗→ 软化→染色→压片→镜 检
解离的目的？如何判断解 离的效果？其他的解离方 法？
5 软化：将解离好的根尖冲洗后，放入45%醋酸 中软化10min左右。
请问解离与软化 的目的是什么？
6 染色：切取1-2mm的分生区，用改良苯酚品 红染液染色10-20min。
为保证染色的 充分要注意哪 些问题？
7 压片：盖上盖玻片，在酒精灯上烤片。然后 固定盖玻片，用铅笔垂直、用力敲击盖片几下，将 材料压成一层细胞。
取材时间？
• 2 预处理：将剪取的新鲜材料于0.02%秋水仙素溶 液中室温下处理3-4h。
预处理的目的？ 还有其他方法吗？
实验步骤：
3 固定：将经过预处理和未经预处理的材料冲 洗后转移至卡诺氏固定液中，室温下处理24h。水 洗放入70%乙醇中保存。
固定的作用？固定剂的组 成？对固定剂配制的要求？
4 解离：将冲洗后的根尖放入0.1mol/L的HCl 中， 60℃下处理8-10min（可视具体情况而定）。
实验材料
• 洋葱、大蒜的鳞茎，玉米、蚕豆的种子等。本实 验选用大蒜。
实验用品
• 用具：显微镜、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、 盖玻片、水浴锅、酒精灯、铅笔、吸水纸等。 • 药品：蒸馏水、卡诺氏固定液、45%醋酸、秋水 仙素、改良苯酚品红染液等。
植物制片技术
二、杀死、固定、保存
✤固定液的选择 根据观察目的和对象，选择固 定剂。同时，要充分考虑植物 种类、不同器官的特性。
二、杀死、固定、保存
✤固定液的渗透力 1）选择固定剂时，要充分考虑 固定液的性质、浓度和温度对 渗透力的影响。 2）植物材料的大小和组织紧密 程度对渗透的影响。
二、杀死、固定、保存
一、选 材
• 叶的切取：横切面。
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
二、杀死、固定、保存
杀死：迅速终结植物材料的生命。要 求越快越好，使用渗透力强的药剂。
固定：在杀死基础上，组织或细胞保 持生活的状态，并在以后制片的过程 中不发生变化。
放入冷水中，促进石蜡短时间内凝 固。 （3）过夜后，取出备用。
五、浸透和包埋
第二章 植物制片技术原理步骤
第一节 选材
第二节 杀死、固定与保存
第三节 清洗与脱水 第四节 透明与过渡
第五节 渗蜡与包埋
第六节 切片
第七节 粘片与展片
第八节 染色
第九节 封片
六、切片
（1）修块： 将包有材 料的蜡块 修成一个 上窄下宽 的台体。 粘在木块 上，即可 切片。
植物显微技术
绪论
一、什么是植物显微技术 用于观察研究植物内部精细结
构的技术方法，包括制片技术、 光学显微镜技术和显微摄影技术， 是一门建立在生物学、化学以及 物理等多门学科基础之上的综合 性技术性学科。
绪论
二、植物显微技术的任务和目的 根据材料的自然特性，观察
植物石蜡切片法显微制片技术
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置
对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶
片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意 刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄 蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时， 需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植 物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）； 对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率 较低。
（五）脱水
• 材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分 解。而且透明剂与水是不相混合的，不利 于材料的透明和包埋等后期处理。因此需 用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让 石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关 键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能 与其他有机溶剂互相替代。
• 脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止 吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水 剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。
• 浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇。
• 每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。
（八）包埋
• 材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡 块，以备切片。
• 操作方法：根据切片材料大小，确定所 需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先 叠好纸盒。
（九）切片
• 即（二）固定
• 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固 定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止， 并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变 化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折 光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新 鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、 大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上 标签。
植物切片制作
植物组织制片技术是随着显微镜的出现而发展起来的技术，是人们认识植物体结构的有效手段，已成为植物生物学的重要组成部分。
植物制片技术已建立了许多方法，现简要介绍如下几种最常见的制片技术：徒手切片法、滑走切片法、离析法、压片法、石蜡制片法和冰冻切片法。
徒手切片法徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察，亦可以通过脱水与染色制成永久制片。
优点：简单、方便，不需要复杂的设备，不经过化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。
用品与材料显微镜、载（盖）玻片、刀片、毛笔、培养皿、吸水滤纸、滴管、ddH2O或清水、1%番红水溶液、菜叶、胡萝卜、马铃薯实验材料对于软硬适中，便于手持的材料，可将实验材料截成适当小块，一般以长2~3cm，切片断面不超过3~5mm2为宜。
对于过于柔嫩的器官（如叶片等），一般可选用胡萝卜根、土豆块茎等作为支撑物，包被住材料后再进行切片。
有时也可将叶片卷成圆筒后再进行切片。
实验步骤1、在小培养皿中放入ddH2O或清水。
2、用左手拇指、食指和中指拿住材料，拇指略低于食指与中指，并使材料略为突出在指尖上面。
3、右手持刀，将刀片平稳地放在左手食指之上，与材料切面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方，斜着向后拉切，切时用臂力而不用腕力。
4、切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片放人培养皿中。
用毛笔挑选透明的薄片，放在载玻片上，用吸管滴一滴水在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片进行观察。
注意事项1、在切片前，要不断地用水湿润材料和刀片。
2、切片时，两只手应该保持活动状态，不要使它们紧靠身体或实验台，且用力不要过猛，不能用刀片挤压材料或来回切割材料。
3、动作要敏捷，材料要一次切下，不要追求切片形状的完整。
简单的组织化学染色经徒手切片法切下的薄片，可以进行简单的组织化学染色，这样更容易分辨细胞的结构，同时可以观察到细胞各部分的化学成分。
植物制片的一般原理
植物制片的一般原理
细胞核染料（碱性染料）： 苏木精，亚甲蓝，中性红，碱性品红，洋 红，地衣红，结晶紫，番红，甲苯绿，碱 蓝。 细胞质染料（酸性染料）： 酸性品红，亮绿，苯胺蓝，固绿，刚果红， 橘红G，曙红，贾纳斯绿，孔雀绿，甲基橙。
植物制片的一般原理
3. 染色方法
⑴死细胞染色。 ⑵活细胞染色。 选无毒性染料。 观察细胞质流、精子或流动孢子等。
植物制片的一般原理
5. 封边剂
石蜡，油漆，指甲油。
植物制片的一般原理
四、染色 一般做成永久切片观察的材料， 都需要染色。
植物制片的一般原理
1. 染色原理
很复杂，难以解释。 ⑴物理学的解释 ①毛细作用或渗透作用而进入组织的内部——因 为组织材料有孔隙。 ②电子吸附作用——因而染色牢度有强有弱。 ⑵化学上的解释 组织或细胞中的各部分，或是酸性的（结合阳离 子，即碱性染料），或是碱性的（结合阴离子， 即酸性染料）。但没有新物质形成。
植物制片的一般原理
⑶醋酸（乙酸，CH3COOH） 单独使用，浓度为0.3－5%。 特点：渗透力大，固定十分迅速，但易使 细胞发生膨胀。 常与甲醛（易引起收缩）混合使用。
植物制片的一般原理
⑷锇酸（OsO4） 四氧化锇，灰黄色结晶，中性，昂贵——白金。 使用浓度为1－2%。 强氧化剂，配制水要超净，不宜与还原性固定剂 配合。 特点： ①最好的固定剂，对细微结构的固定良好，是脂 肪性物质唯一的固定剂。
植物制片的一般原理
④不改变原生质原来的体积（膨胀或缩 小）； ⑤增加细胞内含物折光程度，易于鉴别； ⑥可增加媒染作用和染色能力； ⑦又能有保存作用。 单一的化学药品难以具备以上所有条件； 而几种药品混合，可成近似理想的混合固 定剂。
植物制片的一般原理
徒手切片技术
植物病理徒手制片技术徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。
限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。
(一)整体封藏法对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。
常用方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辨不清。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。
刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原体蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。
浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。
如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。
(二)徒手切片法欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
植物学实验三切片法及根形态
** 封片：染色后，加水封片。（或制成永久标本）
** 观察：去多余液体后，显微镜下观察。
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7
滑走切片：
----利用滑走切片机切片；切片不连续、较厚；多用 于木本茎的切片。
一般步骤：
** 取材：选择用于切片的茎，将其切成小段。
** 软化：用软化剂将材料软化。
方法：A、沸水中煮2小时。
B、50%乙醇/甘油（1：1）浸1-2周。
----以塑料作为包埋剂，在超薄切片机上切片。
切片不连续，薄1 um。
一般步骤：P教材18-23
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9
植物根的形态结构
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10
根系：
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11
根尖分区：
成熟区（根毛区）
伸长区
分生区
根冠区
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小麦根尖分区的观察：
** 载玻片上滴一滴水； ** 取一段小麦根尖（1cm）于载玻片的水中； ** 盖上盖玻片压片后观察。 ** 加碘液后再观察。
5、初生木质部；6、髓
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双子叶植物次生根
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1、表皮
2、皮层
3
3、中柱
4、内皮层
4
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单子叶植物根
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侧根的形成
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根瘤
菌菌 根 可编辑ppt
菌
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1、徒手切片法的学习 ----芹菜叶柄
（观看录像）
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2、根的徒手切片方法
1）取一段植物根（成熟区）1cm于载玻片上； 2）加一滴番红染色1分钟，加水清洗后备用； 3）取萝卜块按要求修整， 4）将根夹在萝卜块中按徒手切片法进行切片， 5）选择好的切片不进行染色处理直接装片观察。
植物制片的染色及显微化学鉴定方法
植物制片的染色及显微化学鉴定方法Revised as of 23 November 2020植物制片的染色及显微化学鉴定方法一、目的与要求1、学习植物制片的一般染色方法。
2、学会并掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞内主要后含物性质的鉴定方法。
二、材料和用品1、自备材料：植物叶片、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等等，解剖器、剃刀或双面刀片。
2、其它材料和用品：显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、吸水纸、蒸馏水、染色缸；%番红、% 固绿或1%苯胺蓝等染液、中性树胶、二甲苯、酒精、碘—氯化锌、盐酸—间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘—碘化钾、10%氯化铁、盐酸等。
三、实验内容1、植物制片的染色方法2、常用显微化学鉴定法四、实验方法1、植物制片的染色方法用徒手切片法切得的薄片，如果仅仅是为了临时观察，制成临时装片即可，这种临时制片不能长久保存，只能作临时观察之用，又由于没经过染色，结构显示的也不够清晰。
为了求得更清晰地显示其细微结构及化学成分，并能够较长时间的保存，可以进一步染色及其它处理以至封片，从而可制成半永久或永久制片。
常用的染色方法是番红—苯胺蓝（或固绿）二重染色法，具体操作方法有二：方法一：（1）将植物切片材料放入30%酒精中，5分钟后移入水中。
（2）用%番红水溶液染色12—24小时。
（3）倒去番红液，用清水冲洗数次后，再放回50%酒精中浸泡5分钟。
（4）将材料从50%酒精中转入70%酒精中脱色，直至硬木质化的细胞壁呈现红色，其它部分呈粉红色或近于无色时为止。
（5） 1%苯胺蓝（用70%酒精配制）对染2—5分钟。
若用%固绿对染，则仅需半分钟左右即可。
注意：此步染色，要不时地在显微镜下检视，切忌染色过深，当木质化细胞壁呈红色，其它部分为淡蓝或淡绿色时，即可停止。
（6）用95%酒精冲去多余染液，再经无水酒精脱水5分钟。
（7）放入等量无水酒精与二甲苯溶液中及纯二甲苯中透明各3分钟。
（8）将切片材料移入载玻片上，在二甲苯未干时立即加一滴中性树胶封片，尔后将玻片平放，自然凉干或置于摄氏35度温箱中烘干。
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植物制片法
一、徒手切片法及临时装片的制作
徒手切片法不需要任何机械设备，只需要一把锋利的刀片，不但方法简单，而且也容易保持植物细胞的生活状态，所以有很大的实用价值。
1. 一般材料的切片方法和步骤
进行切片前，准备一个盛有清水的培养皿，准备好毛笔、刀片等用具。
将要切的材料切成2-—3cm长的小段。
截取材料，削平切面，均应用解剖刀或用过的刀片。
而在作徒手切片时，再用锋利的新刀片，以保证切出合乎要求的切片。
作徒手切片时，最重要的是要切下一小片薄的组织。
例如切某植物茎的横切片时，不要求切下完整的一片，而只需切一小部分能够观察它的组织就行了，有时切的一边厚一边薄，取薄的一侧制成临时装片也有利于观察。
用左手大拇指、食指和中指捏住材料，拇指略低于中指，使材料突出于手指之上，这样以免损伤手指。
右手平稳地拿住刀片，将刀片平放在左手的食指之上，刀刃向内，且与材料断面平行，然后以均匀的力量，从左前方向右后方拉，材料要一次切下，切忌切片中途停顿或前后作“拉锯”式切割。
切片时要用臂力而不要用腕力，而且不要用力过大，也不能用刀片直接挤压材料，或从左右两方向来回切割材料，这样都不能切出合格切片。
切片时为了避免材料枯干，应使材料的切面及刀刃上保持有水，呈湿
润状态。
薄的切片应该是透明的，切片可留在刀刃上继续切，一连切几个切片，然后用蘸水的毛笔把切片取下，放入盛有水的培养皿中，或直接选薄的放在滴有水滴的载玻片上，制成临时装片进行观察。
2. 柔软和坚硬材料的切片法
过于柔软的器官，例如幼嫩的叶子，难于直接拿在手中进行切片。
切时需放在夹持物中，以便于把握操作。
夹持物一般用胡萝卜根、土豆块茎等，将要切的材料夹于其中，然后进行切片。
对于较坚硬的材料，需要经过软化处理才能进行切片。
其软化方法通常是将要切的材料先切成小块，然后在开水中煮沸3—4小时，再浸入软化剂（50％酒精：甘油=1﹕1）中，一昼夜后或更长些时间后再切。
对于已经干燥或富含矿物质而更硬的材料，可先于15％氢氟酸的水溶液中浸渍数周后，使之充分浸透，再置入甘油中软化后方可进行切片。
3. 临时装片的制作
（1）擦净载玻片和盖玻片
擦载玻片：用左手的拇指和食指捏住载玻片的边缘，右手用纱布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好放在干净处备用。
擦盖玻片：先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再用右手拇指和食指用纱布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着纱布慢慢地进行擦拭。
注意用力一定要小而均匀，以免擦碎盖玻片。
（2）用滴头滴一滴蒸馏水于载玻片的中央，再用镊子或毛笔取一薄而透明的材料切片，置于载玻片的水滴中。
（3）盖盖玻片：右手持镊子，轻轻夹住盖玻片的一角，使盖玻片的边缘与材料在左边水滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上。
这样可使盖玻片下的空气逐渐被水挤掉，以免产生气泡。
如盖玻片下水过多，可用吸水纸将多余的水吸掉，这样制好的临时装片就可在显微镜下进行观察了。
二、行（走）切片法或滑行切片法
这种方法是用滑行切片机进行切片,切片性质和徒手切片法相同，只不过是用机械操作而已。
由于机械的帮助，它能按需要调节切片的厚度，切出的切片厚薄均匀，比较完整。
适用于切制较坚硬的材料。
三、石蜡切片法
创建于18世纪，是显微技术上最重要最常用的一种方法，优点是应用范围广，几乎适用于所有的植物材料；能切成极薄而连续的切片，较清楚地显现细胞、组织的细微结构；制片可长期保存，便于以后观察比较。
过程可概括为：取材→固定→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→粘片→染色→封藏。
四、整体封固法
适用于微小的或扁平的材料，例如丝状或叶状的藻类、菌类、蕨类的原叶体、孢子囊、纤小的苔藓植物，被子植物的表皮、花粉粒、幼胚等幼小的器官。
这种方法不需经过切片，就可以显示植物或植物器官的整体。
五、组织离析法
它的原理是用一些化学药品配成离析液，使组织细胞的胞间层溶解，
细胞彼此分离，获得分散的、单个的完整细胞，以便观察不同组织的细胞形态和特征。
六、压片法
是将植物的幼嫩器官如根尖、茎尖和幼叶等经过处理后，被涂抹或压在载玻片上，使组织成一薄层然后进行观察的制片方法。
染色后可作临时的观察标本，也可以经过脱水、透明等手续制成永久的玻片标本。
近年来在植物细胞遗传学等方面的研究中应用极为普遍，特别在染色体数目的检查方面，此法尤为重要。