纯培养分离技术+细菌总数
细菌的分离培养与纯培养实验报告
细菌的分离培养与纯培养实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的分离培养方法，了解纯培养的原理及方法，以及熟悉细菌培养基的制备和使用。
二、实验原理1. 细菌分离培养方法细菌分离培养是指将混合菌落中的单一细菌分离出来，使其在无竞争的环境中独立生长。
常用的方法有均匀涂布法、斜坡涂布法和点式涂布法。
2. 纯培养原理及方法纯培养是指将混合菌落中同一种细菌分离出来并进行单独培养。
常用的方法有挑选法和稀释法。
3. 细菌培养基制备与使用细菌培养基是供给微生物生长发育所需营养物质和条件的一种人工环境。
根据不同需求可制备不同类型的细菌培养基，如寒偏好性、厭氧性、选择性、差异性等。
常用的细菌培养基有普通营养琼脂平板、LB 平板等。
三、实验步骤1. 细菌分离培养（1）取一支无菌的铂丝，将其消毒并冷却。
（2）取一份混合菌落，将铂丝在其表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上。
（4）重复以上步骤，涂布多个琼脂平板。
（5）将琼脂平板放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养。
2. 纯培养（1）取一份混合菌落，在显微镜下观察并挑选出同一种细菌。
（2）取一支无菌的铂丝，在混合菌落表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上，并进行单独培养。
3. 细菌培养基制备与使用（1）按照需要制备不同类型的细菌培养基，并进行消毒灭菌处理。
（2）将需要进行分离或纯化的混合菌落均匀涂布于培养基上，进行培养。
四、实验结果1. 细菌分离培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上出现单一的细菌菌落。
2. 纯培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上只有挑选出的同一种细菌菌落。
3. 细菌培养基制备与使用制备好的细菌培养基可用于分离、纯化和大量繁殖特定细菌。
五、实验注意事项1. 实验器材需消毒并严格无菌操作。
2. 均匀涂布法需注意铂丝在琼脂平板上均匀涂布。
3. 液体培养基需注意摇晃均匀以使细菌均匀分布。
4. 实验结束后要彻底清洗和消毒实验器材和工作台面。
微生物纯培养—分离纯化方法汇总
微生物纯培养—分离纯化方法汇总含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（mixed culture）。
如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（pureculture）。
在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化，方法有许多种。
１、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。
单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。
３、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。
用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
富集培养法的方法和原理非常简单。
我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。
如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。
通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
５、厌氧法在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。
然后快速冷却，并进行接种。
接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。
另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。
细菌分离提纯实验报告
细菌分离提纯实验报告细菌分离提纯是一项常见的实验技术，通过这项技术可以从混合菌液中分离出单一的、纯净的细菌菌落。
这项技术在生物学、医学、环境科学等领域都有广泛的应用。
细菌分离提纯的实验步骤主要包括：取样、制备稀释液、涂布平板、培养菌落、筛选菌落、鉴定细菌。
首先，取样是细菌分离提纯的第一步。
当我们需要分离某种细菌时，我们需要从含有该种细菌的样品中取样。
比如，我们可以从水样、土壤样、食品样、人体样等中取样。
然后，制备稀释液。
我们对取样物进行稀释，使得其中的细菌数目降到一定范围内，以便于后续的细菌分离。
通常我们会选择使用生理盐水、缓冲液等来制备稀释液。
接下来，将稀释液涂布在平板上。
我们通常会使用琼脂平板来进行细菌分离提纯实验。
将稀释液均匀涂布在琼脂平板上，然后用培养皿盖好，放入恒温培养箱中进行培养，通常在适宜的温度下进行培养24-48小时。
培养过程中，我们可以观察到平板上出现的不同形态的菌落。
可以根据菌落的形态、颜色、大小等特征来进行筛选。
一般我们会选择孤立的、圆形的、透明或者白色的菌落作为目标菌落。
当我们筛选出目标菌落后，我们需要进行鉴定。
通常我们可以根据细菌的生理生化特性、抗生素敏感性、分子生物学特征等来鉴定细菌的种属。
可以使用生理生化试剂盒、PCR技术、16S rRNA测序等方法进行鉴定。
最终，根据鉴定结果，我们可以获得目标细菌的纯种菌株。
这些纯种菌株可以用于进一步的实验研究，如基因克隆、发酵生产等。
细菌分离提纯实验需要注意以下几点。
首先，取样要注意无菌操作，避免采样器具的污染。
其次，涂布平板时要注意均匀涂布，以避免菌落的融合。
另外，培养过程中要注意恒温，避免细菌在高温或低温下死亡。
总之，细菌分离提纯是一项重要的实验技术，在微生物学研究中起到了至关重要的作用。
通过细菌分离提纯技术，我们能够从混合菌液中得到纯净的细菌菌落，为后续的实验提供了可靠的菌种资源。
这项技术的应用涵盖了多个领域，对于推动生物科学的发展具有重要的意义。
细菌总数测定方法
细菌总数测定方法细菌总数测定是一种用来确定给定样品中存在的细菌总数量的方法。
在微生物学和生化学领域中，细菌总数的准确测量对于研究微生物活动、食品安全、健康和环境健康等方面非常重要。
下面将详细介绍细菌总数测定方法的原理、步骤和常用技术。
1. 细菌总数测定的原理：细菌总数测定的原理基于细菌的生长和繁殖特性。
在适宜的培养条件下，细菌会通过二分裂等方式进行繁殖。
通过培养基的可见菌落计数或显微镜下的细胞计数，可以得出给定样品中的细菌总数。
2. 细菌总数测定的步骤：（1）制备培养基：根据需要培养的细菌类型选择适宜的培养基，如普通营养琼脂培养基（Nutrient Agar）、肉汤葡萄糖琼脂培养基（Tryptone Glucose Yeast Extract Agar）等。
制备过程中要注意无菌操作，以避免外源性细菌的污染。
（2）样品制备：将待测样品适当稀释，以使细菌总数在可计数范围内。
稀释液可以选择生理盐水、磷酸盐缓冲液等。
（3）接种培养：将稀释好的样品分别接种在含有适宜培养基的琼脂平板上。
通过平板接种法或涂布法使细菌均匀分布于琼脂表面。
（4）培养条件控制：将接种好的琼脂平板放入恒温培养箱中，在适宜的温度和湿度下培养。
常见的培养温度为37，培养时间根据细菌类型和繁殖速度确定，通常为18-24小时。
（5）细菌计数：培养一段时间后，通过可见菌落计数或显微镜下的细胞计数确定细菌总数。
对于可见菌落计数，需要计算样品中每个可区分的菌落单元数。
对于显微镜下的细胞计数，可以使用像计数室或显微镜装置来准确计数细菌。
3. 常用细菌总数测定技术：（1）可见菌落计数法（plate count method）: 将稀释好的样品通过平板接种法均匀播种在琼脂平板上，通过培养后可见菌落数来确定细菌总数。
这是一种简单、常用的方法，适用于可培养的细菌。
（2）显微镜计数法(microscopic count method)：通过显微镜下观察直接计数细菌细胞数来确定细菌浓度。
细菌总数名词解释
细菌总数名词解释细菌总数，又称菌数，是指一个立方体内所含的细菌的总数。
细菌总数的计算方法为：以样本中所含菌数占总样本菌数的百分率表示，如每克干固体标本或每毫升液体标本中所含的菌数，即为细菌总数。
细菌总数常用每克（或毫升）干固体标本或每毫升（或毫升）液体标本中所含的细菌菌落数来表示，它表示某一个地区、某一环境中所有存在于固体或液体培养基上的细菌菌落总数。
同时细菌总数也可作为细菌学研究、细菌污染及医疗事业防疫措施的依据之一。
细菌总数测定仪器主要有光密度计和光计数管。
前者的读数原理为折射原理，后者的读数原理为散射原理。
在大多数情况下，当需要估计菌数总量时，可采用光密度计；如果需要测定浓度范围很宽的标本中的细菌菌数总量，则可采用光计数管。
但是在液体培养基中进行测定时，只能使用光密度计。
测定细菌总数的光密度计按结构特点又可分为自然光密度计和荧光显微镜两种。
光密度计有一套检测系统和计数系统。
它们一起保证了读数的准确性。
在使用光密度计测定细菌总数时，需对标本稀释成不同的稀释度，然后以一定的稀释度从标本中吸取适量的菌悬液，装入反应管内，加满冷凝管，使之与空气隔绝，在显微镜下进行计数。
由于菌悬液中各细菌的分布状态不一致，有些细菌密集在上层，而有些细菌则沉降到底部。
因此在使用光密度计测定总菌数时，应同时取几管混匀，以便观察。
在正常情况下，菌悬液经10— 20分钟就会被均匀分散开，这时可看到红色视野中出现许多白色小圆圈，或看到红色视野里有细小的圆形光亮区。
随着细菌总数的增加，红色视野中小圆圈的直径逐渐变小，红色视野逐渐缩小。
当菌数达到一定数量时，圆圈消失，变成无数小亮点，最后细胞集结成云雾状或团块状。
1、数值测定法用肉眼、光镜或低倍镜观察标本，计算在一定体积或重量的细菌菌体所占的百分比。
2、化学测定法用化学药品、酶制剂处理标本，通过颜色反应和显色反应来计数细菌菌体，有关细菌数量的计数单位还有个细胞，活菌数，活菌个数等。
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
测定细菌总数的方法通常包括以下几种：
1. 显微镜计数法：将待测样品制成适当浓度的悬浮液，然后使用显微镜观察计数。
这种方法常用于观察对显微镜可见的大型细菌。
2. 平板计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，然后在固体培养基上均匀涂布。
经过适当时间后，可数出单个菌落的数量，并根据稀释倍数计算出细菌总数。
3. 涂布计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，通过草屑涂布或涂布棒均匀涂布在固体培养基上。
经过适当时间后，可数出涂布上细菌的总数。
4. 易液化琼脂凝胶计数法：将待测样品制成适当稀释度的悬浮液，与液化琼脂凝胶混合，然后倒入琼脂凝胶平板上固化。
经过适当时间后，可数出液化琼脂凝胶上细菌的总数。
5. 流式细胞仪计数法：将待测样品进行适当稀释后，通过流式细胞仪对样品中的细菌进行单个细胞的计数和分析。
这种方法快速、准确，适用于大批量的细菌计数。
需要注意的是，不同的方法适用于不同类型的细菌和样品，选择合适的方法对准
确测定细菌总数十分重要。
此外，测定细菌总数时需要注意消毒、防止交叉感染等实验操作安全。
细菌总数的测定法资料
细菌总数的测定法细菌总数的测定法一、细菌数测定的基本概念药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。
细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2供试品液经培养后所生长的菌落数。
所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，30～35℃，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。
细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。
药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。
故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。
平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。
在试验操作中应考虑到这此问题。
二、设施、设备、仪器及器皿1、设施细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。
2、设备、仪器恒温培养箱（30～35℃）、微波炉、匀浆仪（4000～10000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定）菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。
3、器皿锥形瓶（250～300ml ）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×18mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。
细菌总数测定方法
细菌总数测定方法
常用的细菌总数测定方法有以下几种：
1. 直接计数法：将待测细菌样品进行稀释，然后用显微镜直接计数在计数板或用计数室计数盘，最后通过计算平均细菌数来估计总数。
2. 涂布法：将待测细菌样品均匀涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度下培养一定时间后，以形成菌落个数来估计总数。
3. 膜过滤法：将待测细菌样品通过孔径合适的过滤膜，然后将膜放入适宜的培养基上进行培养，通过统计菌落数来推算总数。
4. 测定细菌生物学活性法：通过测定某些活性细菌所产生的酶活性或特定代谢产物的含量来推测总数。
这些方法各有优缺点，选择适当的方法需要根据实验需求、样品特点和实验条件进行综合考虑。
细菌纯种分离、培养和接种技术
实验三细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。
(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。
(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
二、实验原理水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。
它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。
目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。
因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。
水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。
滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。
三、实验材料1、菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
2、大肠菌群的测定：1)培养基：①乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g，胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。
制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，121℃灭菌15min。
②伊红美蓝琼脂培养基：制法：将伊红美蓝琼脂粉溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
平板划线法：接种是采用平板划线的方法将初发酵的大肠杆菌进行接种。
四、实验方法1、水样的采集：1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。
分离纯化和平板计数
分离纯化和平板计数一、实验目的：掌握平板制备和涂布技术、菌液的稀释、四分区划线法和平板菌落计数法。
二、实验原理：培养基融化方法有电炉上加热融化（注意：大火煮开，文火慢炖；化透，而不溢出。
）；微波炉融化；灭菌锅融化（溶解保温，参数100度30分钟）。
获得最佳分离效果时，菌落密度100个/平板较合适，而一般的起始菌液浓度可达到108-109个/ml，因此需要稀释105-106倍。
常用的系列稀释法：10倍系列稀释。
以稀释原理为基础，建立的固体培养基分离纯培养的基本方法：平板划线法、倾注平板法、涂布平板法。
平板划线法：稀释过程发生在固体平板的表面，既是稀释的过程，也是接种的过程，两步并做一步走。
涂布平板法是使用较多的常规方法，克服了倾注平板法的缺点，但有时涂布不均匀。
计数法适用于细菌、酵母等单细胞微生物，以及放线菌和霉菌的孢子。
显微镜下的直接计数法包括血球计数板、细菌计数板，间接计数法——活菌计数法包括平板菌落计数法、膜过滤培养法。
微生物计数目的是测定微生物的生长、微生物检测等。
平板菌落计数法——活菌计数法原理：每一个单个的微生物细胞在合适的培养基和生长条件下，可以在平板上通过生长形成菌落。
通过菌落数量的计数，计算样品中的活菌数。
三、实验材料：LB固体培养基，酒精灯，培养皿，无菌水试管，菌液，移液管，涂布器，接种环。
四、实验步骤：LB平板制备：1、灭菌锅融化LB固体培养基，溶解保温，参数100度30分钟。
2、冷至55-60度左右（不烫手为宜）。
3、无菌操作，倒平板。
右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拔出，试管口或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指（环指）夹住试管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。
如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次用完，试管塞或瓶塞则不必加在手中）。
左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法细菌总数测定是微生物检测领域中的一项基本技术，它对于保障食品、药品和环境安全具有重要意义。
通过测定细菌总数，可以评估产品的卫生状况及污染程度，进而采取相应的控制措施。
本文将介绍几种常见的细菌总数测定方法。
平板计数法平板计数法是最传统也是最常用的一种细菌总数测定方法。
该方法通过将样品稀释液均匀涂布在含有营养培养基的平板上，经过一定时间的培养，根据生长出的菌落数量来估算样品中的细菌总数。
具体步骤包括：1. 制备适宜的稀释液。
2. 将稀释液接种到含有固体营养培养基的平板上。
3. 在恒温条件下培养一定时间（通常为24-48小时）。
4. 对形成的菌落进行计数，并乘以相应的稀释倍数得出细菌总数。
膜过滤法膜过滤法适用于液体样品中细菌数量较少的情况。
通过使用特定孔径的滤膜过滤样品，将细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放置在营养培养基上培养，最后统计菌落数量。
此方法的优点是可以检测到比平板计数法更低浓度的细菌。
直接计数法直接计数法通过显微镜直接观察和计数样品中的细菌。
常用的有活菌计数和死菌计数两种。
活菌计数通常使用荧光染色剂，如吖啶橙或DAPI，使细菌细胞发出荧光，然后在荧光显微镜下进行计数。
而死菌计数则需使用特定的染色剂，如碘化丙啶(PI)，标记死亡的细菌细胞。
流式细胞术流式细胞术是一种高速分析单个细胞的技术，能够对大量细胞进行快速计数和分类。
在细菌总数测定中，流式细胞术可以通过特定的荧光标记物识别和计数细菌细胞。
这种方法速度快，精度高，但设备成本较高。
分子生物学方法随着分子生物学技术的发展，基于PCR的方法也被用于细菌总数的测定。
通过对细菌的特定基因序列进行扩增和定量分析，可以实现对细菌总数的准确测定。
这种方法灵敏度高，特异性强，但需要专业的实验操作和分析技能。
总结而言，不同的细菌总数测定方法各有优缺点，选择合适的方法需根据样品特性、实验条件和测定目的综合考虑。
无论采用哪种方法，都必须严格遵守无菌操作规程，确保实验结果的准确性和可靠性。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
交叉划线法
连续划线法
平板菌落计数法根据微生物在固体培养基上所形成的 菌落一般由一个细胞繁殖而成的原理进行。即一长成的菌 落代表一个活的细胞。计数时先将待测样品作一系列稀释， 使其中的微生物充分分散成单个细胞，再吸取一定量的稀 释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基 内，经培养单个细胞繁殖形成菌落，统计菌落数目即可计 换算出样品的含菌数。
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
－ －
3.78 ×104 2.71 ×104
5.13 ×105 2.70 ×102 采用科学计数 法；取两位小 数
６
无法计数
305
12
－
3.05 ×104
“无法计数”——指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数， “0”——指平板上无微生物菌落生长。
五、作业
1、将每一个稀释度的三个平板上的菌落数填入下表，并计算结果
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
（5）涂布平板 无菌操作，用胶头滴管分别移取10-4、 10-5、 10-6稀释菌液各200 uL于相应编号的培养皿中， 用无菌涂布棒在培养基表面轻轻涂布均匀。（注意： 涂布棒火焰灼烧，冷却后再涂布，否则温度太高导致 菌体死亡） （6）培养及计数。将涂布好的平皿放入37℃培养箱中 倒置培养。 2、菌落计数 培养48 h后取出培养皿，算出同一稀释度的三个平 皿中平均菌落数，再按公式计算每毫升样品中活菌数。
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数
微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数关键词：微生物分离纯化计数实验原理稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。
一般用于某些产品检定，如根瘤菌剂等产品检定，生物制品检验，土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。
为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的，因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。
土壤中的微生物数量、种类与土壤肥力有关，肥沃的土壤中多，贫瘠土壤中少。
其生理类群则与土壤的其它理化性质，如通气、pH有关，例如在通气良好的菜园土中，好气性微生物占有绝对优势。
本实验以菜园土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行数量测定。
分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求的不同，供给它们适宜的生活条件，或加入某种抑制剂造成只利于该菌种生长，不利于其它菌种生长的环境，从而淘汰不需要的菌种。
分离微生物常用的方法有稀释平板分离法和划线分离法，根据不同的材料，可以采用不同方法，其最终目的是要在培养基上出现欲分离微生物的单个菌落，必要时再对单个菌落进一步分离纯化。
在用稀释平板分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。
细菌总数名词解释
细菌总数名词解释细菌总数指从正常人体或正常居住的地方采集到的标本中所含微生物的总数。
菌落是指单个细菌排列成的集合体。
定义：体积(长×宽×高)为0.5×10^6－ 10^7 cells。
即体积为5×10^6－ 10^7 cells。
可分为有形菌落和无形菌落两种类型。
有形菌落:指细菌的大小及形态特征，如细胞大小、形状、表面结构等;无形菌落:1、指直径在1～100μm，多呈圆形、卵圆形或不规则形的单个细菌菌落。
由有关部门规定的标准是3×10^5 cells/ml。
2、指直径在100～1000μm，边缘光滑整齐的一群细菌菌落。
由有关部门规定的标准是5×10^5 cells/ml。
3、指直径在1000～5000μm，边缘不整齐的一群细菌菌落。
概念：细菌总数指从正常人体或正常居住的地方采集到的标本中所含微生物的总数。
菌落是指单个细菌排列成的集合体。
细菌总数又称细菌繁殖指数。
定义：单位时间内每克样品中所生长出的细菌菌落总数。
微生物学检验中细菌总数的计算方法，首先根据样品中各种微生物的生理特性，测定其活力；然后将各种微生物的活力依次除以菌落总数求得单位时间内每克样品中所生长出的细菌菌落总数。
测定方法:将纯培养物接种到血琼脂平板上进行培养，第三天计算菌落数。
如果平板上某一处生长了多个菌落，就取平均值作为该处的菌落数。
要注意选择好培养基，防止菌种衰老或死亡而影响测定结果。
测定结果以每毫升样品中所生长出的细菌菌落总数表示，也可用菌落总数／ 100表示。
若以每升样品中所生长出的细菌菌落总数表示，即为每升样品中的细菌总数／升。
2、细菌总数与菌落总数的比较3、细菌总数与粪便直接观察的判别区别点4、大肠埃希氏菌对热的耐受范围5、血浆凝固酶原时间(PT)6、伤寒沙门氏菌抗原(N h)，伤寒沙门氏菌抗原(N h),血浆凝固酶原时间(PT)，伤寒沙门氏菌抗原(N h),PT,PT是细菌产生内毒素所需的一种条件，如果抑制伤寒沙门氏菌产生内毒素的活性，内毒素不能被有效地灭活，那么机体在免疫过程中将发生严重的超敏反应。
细菌总数的计算方法
细菌总数的计算方法一、直接计数法直接计数法是通过对细菌进行可见光显微镜观察，并使用计数室将细菌数量统计出来。
这种方法可以对样品中的所有细菌进行计数，包括活细菌和死细菌。
1.视觉法：这种方法利用显微镜对细菌进行观察和计数。
首先，将样品涂布在载玻片上，然后在显微镜下使用适当的目镜和物镜来观察细菌，使用计数室将细菌数量统计出来。
2.过滤法：这种方法适用于样品中细菌数量很大的情况。
首先，将样品经过滤器过滤，然后将过滤器放在培养基上进行培养，最后对培养基上细菌进行计数。
3.流式细胞仪法：这种方法适用于样品中的细菌数量很小的情况。
流式细胞仪会将细菌进行分散并单个通过激光束，然后通过光散射、荧光标记等方法对细菌进行计数和鉴定。
二、间接计数法间接计数法是通过测量细菌的生长特性来估计细菌总数。
这种方法可以很快得到结果，但只能对活细菌进行计数。
1.湿涂法：这种方法基于细菌在固体培养基上形成的菌落数来估计细菌数量。
首先，将样品通过稀释后涂布在固体培养基上，培养一段时间后，观察并计算形成的菌落数。
2.光密度法：这种方法利用测量细菌培养液中的光密度来估计细菌数量。
细菌培养液的光密度与细菌浓度呈正相关关系，可以通过分光光度计等仪器来测定光密度。
3.ATP酶法：这种方法基于细菌细胞内的ATP含量与细菌数量呈正相关关系。
通过检测样品中的ATP含量，可以估计细菌数量。
细菌总数的计算方法并不仅限于上述的几种，科学家们还在不断发展和改进计数方法。
但无论哪种方法，准确性都是一个重要考量因素。
因此，在进行细菌计数时，需要选择适当的方法，并结合标准曲线、稀释方法等进行校正和验证，以保证结果的准确性。
细菌总数的测定
2、 倒平板 熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平
板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。
3、编号 取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-3、10-4、
10-5、10-6、10-7。 4、分装无菌水
按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的 各无菌空试管中。
固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单 位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。
8. 计数
选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀 释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300 之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换 算成每克干土所含菌数。
样品的处理和稀释
25g或25ml 检样
充分振摇或研磨
225mL稀释液
1ml
含有玻璃珠的灭
1ml
菌玻璃瓶或乳钵
1：10稀释液。 1ml
9ml稀释液 1：100
操作要求：“无菌操作”贯彻始终。
9ml稀释液 1：1000
9ml稀释液 1：10000
环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。
5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。
6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。
计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。
微生物的分离纯培养
稀释倒平板法先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如 1 ∶10 、1 ∶100 、 1 ∶1000 、 1 ∶10000 …），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45 ℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。
如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。
随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
涂布平板法原理：将一定浓度，一定量的待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，使长出单菌落而达到分离的目的。
由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平台法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。
平板划线法步骤:用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。
是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
用于目的微生物的分离。
特点：快捷、方便、便于得到目的性状的单克隆。
三种方法的区别稀释涂布法：优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。
一般用于平板培养基的回收率计数.稀释混合平板法：优点：可以计数，吸收量为1ml，较方便。
缺点：不能观察菌落特征。
一般用于菌落总数的计数.平板划线法：优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离.缺点：不能计数一般用于从菌种的分纯.。
细菌总数
细菌总数细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
一平板法1 应用范围1.1 本法适用于测定饮用水和水源水中的细菌总数。
1.2 所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。
因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。
2 原理每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质）去满足其要求，才能分别地将各种细菌培养出来。
在实际工作中，不可能做到。
一般是根据测定要求而采用常用方法进行细菌总数的测定，所测定的结果，只包括在所使用的条件下生长的细菌总数。
3 仪器3.1 高压蒸汽灭菌器。
3.2 干热灭菌箱。
3.3 恒温箱。
3.4 冰箱。
3.5 放大镜。
3.6 试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中160℃灭菌2h。
4 培养基4.1 成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂10~20g蒸馏水1000ml4.2 制备将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，过滤，分装于玻璃容器中，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
5 步骤5.1 生活饮用水5.1.1 以无菌操作方法用灭菌吸管1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml 已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样有培养基充分混匀。
每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
5.1.2 待冷却凝固后，反转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1ml中细菌总数。
5.2 水源水5.2.1 以无菌操作方法用灭菌吸管1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：10稀释液。
5.2.2 吸取1：10稀释液1ml注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。
按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液等备用。
微生物的纯培养、分离纯化与平板计数
微生物的纯培养、分离纯化与平板计数一．实验目的1.了解微生物纯培养的目的与方法。
2.掌握分离纯化微生物的几种方法。
3.掌握通过用涂布平板法对微生物进行计数的方法。
二．实验原理1.微生物纯培养的原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。
人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。
通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，纯培养物通常是通过人工培养方法获得的。
获得纯培养物的关键有两点：（1）所有相关物品必须是无菌的。
（2）分离单个微生物细胞并将其培养成一个群体。
2.分离纯化微生物的几种方法从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
混合样品的分离方法包括两大步骤，使菌体浓度得到稀释使微生物的细胞或孢子以单独的状态存在，在适宜条件下形成菌落。
如果将其接种到适当的培养基上就得到了纯种的微生物。
分离纯化微生物的方法包含两类：一是达到菌落水平，另一类是达到细胞水平。
菌落分离纯化方法包括：平板划线法，平板涂布法和倾注分离法。
细胞分离纯化方法包括：单孢分离法和菌丝顶端切割法。
平板划线法，平板涂布法和倾注分离法因方法简便、设备简单分离效果良好而被广泛使用。
（1）平板划线法原理：当通过划线法分离微生物时，培养物在固体培养基上通过划线被稀释。
划线的目的是使细菌细胞间的空间足够大，这样单个细胞繁殖所产生的大量后代就会形成一个菌落。
由此可见，菌落就是在固体培养基表面由单个微生物繁殖形成的肉眼可见的细胞集团，菌落也可以是由一群同类微生物繁殖形成。
挑取但菌落进行扩大培养就是纯培养。
（2）平板涂布法原理：将经过适当稀释的一定体积的菌液加到已凝固的平板培养基表面，然后用无菌涂布器速将其涂布均匀，如果涂布适宜，经培养后，在平板表面可以得到但菌落，从而达到离纯化微生物的目的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母菌落
大多数酵母菌 的菌落特征与 细菌相似，但 比细菌菌落大 而厚，菌落表 面光滑、湿润、 粘稠，容易挑 起，菌落质地 均匀，正反面 和边缘、中央 部位的颜色都 很均一，菌落 多为乳白色， 少数为红色， 个别为黑色。 有“酒香味”
放线菌菌落特征：
放线菌菌落
放线菌菌丝相互 交错缠绕形成质 地致密的小菌落， 干燥、不透明、 难以挑取，当大 量孢子覆盖于菌 落表面时，就形 成表面为粉末状 或颗粒状的典型 放线菌菌落，由 于基内菌丝和孢 子常有颜色，使 得菌落的正反面 呈现出不同的色 泽。有"泥腥味"
操作要点：注意无菌操作 1.取样：25g(ml)样品＋225ml无菌水＝10倍稀释样液 样液处理:(P192)饼干、酱油、冰激凌、果冻、自来水 164×106＝1.64×108菌落/1g 2.稀释：1ml样液＋9ml无菌水→一次稀释至10－7 46×107/295×106=1.6＜2,取二者平均值 1365 164 20 3.到平板：1ml样液＋培养基25～30ml→混匀→冷却 60×107/271×106=2.2＞2,取稀释度较小的值 2760 295 46 所有稀释度均﹥300，取稀释度最大的值 4.贴标签→倒置→37℃培养48h 2760 271 60 所有稀释度均＜30，取稀释度最小的值 结果记录：P177 无法计数 4650 所有稀释度均不在30～300，取最接近30 513 结果分析： 或300的稀释度的值
【实验】 十一 微生物分离纯化及无菌操作技术P
组别 一组 培养基名称 牛肉膏蛋白胨 培养基 实验材料 (稀释液) 土 壤 稀 释液 实验方法 （平板法） 稀释平板法(半) 平板划线法(半) 涂布法(半) 平板划线法(半) 稀释平板法(半) 涂布法(半) 稀释平板法(半) 涂布法(半) 培养对 象 细 菌 培养 时间 2~3d
（一）微生物接种技术
3
1.斜面接种法 P215
1 5 6
2 4
菌种管在前，接种管在后，管口对齐，斜面向 上，斜持试管10～45°，不要持成水平
（一）微生物接种技术 2.穿刺接种法
P215
（一）微生物接种技术
3. 液体接种法
（二） 微生物分离纯化技术 无菌吸取方法
（二） 微生物分离纯化技术 1. 稀释平板法
霉菌的菌落较大， 有的霉菌的菌丝 蔓延，其菌落可 扩展到整个培养 皿，有的种则有 一定的局限性， 直径1-2厘米或 更小。菌落质地 一般比放线菌疏 松，外观干燥， 不透明，呈现或 紧或松的蛛网状、 绒毛状或棉絮状； 菌落与培养基的 连接紧密，不易 挑取；菌落正反 面的颜色和边缘 与中心的颜色常 不一致。
菌 落
气味
一般有臭味
多带酒香
有泥腥味
有霉味
菌落特征描写 菌名
大小 形态 干湿 光滑 湿润 粘稠 同上 透明 度 结合 度 颜色 正反 差别 气味 生长 速度
大肠 小而 杆菌 突起
葡萄 酵母 较大 而厚
圆点状 圆形
半透明 不结合 土黄色 无 不透明 同上 不透明 紧密 乳白色 无 土黄色
臭
快
酒香 较快 泥腥 慢 霉味 较快
同上
小薄 放线菌 致密 黑根霉 大而疏
放射状 干燥 干燥 干燥 干燥 干燥
有 有 有 有
无 松蔓延 网状 大而 圆形 黑曲霉 疏松 绒状 大而 疏松 大而 桔青霉 致密 黄曲霉 圆形 绒状 圆形 皱褶
不透明 较紧密 黑色 不透明 较紧密 黑色 不透明 较紧密 黄色
较快
同上 较快 同上
不透明 较紧密 灰绿色 有
微生物类别 菌落特征 含水情况 外观特征 菌落透明度 参 考 特 征 菌落与培养基结 合度 菌落的颜色 正反面颜色差别 细胞生长速度
单细胞微生物
细菌 很湿或较湿 小而突起 或大而平坦 透明或稍透明 不结合 多样 相同 一般很快 酵母菌 较湿 大而突起 稍透明 不结合 单调 相同 较快
菌丝状微生物
放线菌 干燥 小而紧密 不透明 牢固结合 十分多样 一般不同 慢 霉菌 较干燥 大而疏松 或大而致密 不透明 较牢固结合 十分多样 一般不同 一般较快
11 5 取平均菌落数30~300的结果报告 无法计数对照组 12 305 27
实验报告总结一：关于菌落特征
单个或少数细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心 的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团，这 就是菌落。
大肠杆菌平板菌落
细菌菌落常 表现为湿润、 粘稠、光滑、 较透明、易 挑取、质地 均匀以及菌 落正反面或 边缘与中央 部位颜色一 致等。细菌 的菌落特征 因种而异。 有“臭气味”
6.1 微生物的纯培养
纯培养：在无菌（无活的微生物存在）条 件下通过分离和培养就可获得只含一种微 生物的培养物即纯培养。
纯培养的分离技术——重点
（一） （二） 微生物接种技术 微生物分离纯化技术
பைடு நூலகம்
无菌技术
概念：将微生物分离、转接及培养时防止 被其他微生物污染的技术，称为无菌技术。 1、对使用的器具及培养基的灭菌 2、创造无菌的环境 无菌箱、超净工作台、无菌室 工作服、酒精消毒手及台面 操作过程，使用前需灭菌 工作完的材料需消毒处理 不许吃东西
二组
豆芽汁葡萄糖 活性干酵母 培养基 稀释液 高氏一号 培 养基 PDA培养基 土 壤 稀 释液 霉变橘皮稀 释液
酵母菌
3~4d
三组
放线菌
7~10d
四组
霉 菌
5~7d
【备注】每人做相应的平板1个，相应的斜面1支
【今天实验】十四 食品中细菌总数测定（P218）
原理：细菌菌落总数 / 1g(1ml)样品中 10倍稀释样液
较快
考考你
实验报告总结二
1
2
3
4
摇平 冷却
倒入量：15～20ml 倒入温度：45～50℃
倒置培养
（二） 微生物分离纯化技术 2. 平板划线法
1）连续划线法 2）分区划线法
起点2 起点1 灼烧
待分离菌液
起点3
（二） 微生物分离纯化技术 3. 平板涂布法
15稀释平板测数法 （混融法和涂布法
6.1.3 微生物的培养方法
1、好氧培养 （1）固体培养 （2）液体培养 2、微需氧培养 3、厌氧培养 焦性没食子酸法 厌氧罐法 CO2培养法