建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎｏ ２００４８３３∞１∞４．
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２００８ ０６－１８
Ａｃｃｅｐｔｅｄ；２００８－１２－１０
Ａｂｓｔｒａｃｔ ＢＡＣＫＧＲ０ｌＵＮＤ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ＢＭＳＣｓ）ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｅｅｄ ｃｅｌＩｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｅｌｄｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ．ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＢＭＳＣｓ ｉｓ ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ． ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｈａｒｖｅｓｔ ｒａｔ ＢＭＳＣｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉｏｕｓ ｍｅｔｈｏｄｓ。ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｃｅｌＩ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ—ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａＩ ｄｉ仟ｅｒｅｎｔｉａｔｊＯｎ．
ＢＭＳＣｓ．
Ｙａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ ＲＨ，Ｘｉｅ ＨＪ，Ｃａｉ Ｙ。Ｈｕａｎｇ Ｆ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｔ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｚｕｚｈｉ Ｇｏｎｇｃｈｅｎｇ Ｙａｎｊｉｕ ｙｕ Ｕｎｃｈｕａｎｇ Ｋａｎｇｆｕ ２００９；１ ３（６）：１ ０６４－１０６８（Ｃｈｉｎａ） 【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｆｅｒ．ｃｎ ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎｌ
１２６，ｃｏｍ
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ：ｔｈｅ ＮａｂＯｎａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄｅｔｉｏｆｔ ｏｆＣｈｉｎａ．Ｎｏ． ３０４７２２７４。：ｔｈｅ ＳｐｅｃｉａＪ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ＴｒａｄｉｔｉｏｎａＩ Ｃｈｉｍ＊ｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏ． ０４—０５ＪＬｌ９。：ａ ｇｒａｎｔ ｆｒｏｍ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａ啊ｏＲ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｎｏ．０４１０５８３７。：ａｎ Ａｃｃｅｎｔｅｄ ａｎｄ Ｌｅａｄ Ｔ０ｒｍ ｆｒｏｍ ＳｏｃｉａＩ
建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定米宰冰术☆
杨丽１，张荣华１，谢厚杰２，蔡宇１，黄丰３
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方法：无茼条件下分离大鼠双下肢，低糖ＤＭＥＭ培养液冲出骨髓，分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓 间充质干细胞。利用差速贴肇原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第３代骨髓问充质干细胞，分别加入成骨、成脂，
成软骨诱导培养基，培养１４ ｄ。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质千细胞的牛长状态，流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达，采用碱性磷
ＣＯＮＣＬＵＳｌＯＮ：ＢＭＳＣｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｖｅ ａ ｇｏｏｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｕ【ｃｅｍｅ ｉｓ ｂｅｔｔｅｒ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｒａｌ ＢＭＳＣｓ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性，经鉴定为大鼠骨髓间充质干细 胞。
关键词：骨髓间充质干细胞：大鼠；分离：鉴定
杨丽。张荣华，谢厚杰，蔡宇，黄丰．建立大鼠骨髓问充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，
２００９，１３（６）：１０６４—１０６８
。Ｄｅｐａｒｂｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍａｔｅｒｉａ
Ｍｅｄｉｃａ，。Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｃｏｉｌｅｇｅ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ蚍
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３２．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａ； 。Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｅｐａｎ＇ｍｅｎｔ， Ｄｉｓａｂｌｅ Ｖｅｔｅｒａｎ Ｒｅｈａｂｉｌｉｔｅｔｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２６０．Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ。Ｃｈｉｎａ
目前还没有单一某种特异性的方法用来 鉴定骨髓问充质干细胞，因此实验采用形态学 观察初步判断骨髓间充质干细胞，然后通过表 面标志物的表达以及在诱导条件下对其多向 分化能力的判定，逆向证明体外分离培养的细 胞是否为骨髓间充质干细胞，以确立高效稳定 的大鼠骨髓问充质干细胞分离培养体系和鉴 定方案。
１材料和方法
【ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｏｒｇ ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎ】
万数据
只Ｄ．Ｂｏｘ １２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００４ ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎ
扬丽．等建立太鼠骨髓同充硬干细魄稳定分离培莽体系ｓ簦定
０引言
骨髓间充质干细胞是具有自我复制和多 向分化潜能的非造血干细胞［１－２］。目前用于分离 骨髓间充质干细胞的方法毛要有４种：全骨髓 贴壁法，贴壁筛选法、密度梯度离心法、细胞表 面分子标记分选法、细胞筛筛选法，其中以全 骨髓贴壁法和密度梯度离心法最为常用。后两 种方法虽然分离出的细胞纯度高，但由于分离 细胞数量少，活性低，加之技术难、成本高， 因此较少采用。
ＤＥＳＩＧＮ．ＴＩＭＥ ＡＮＤ ＳＥＩＴＴＩＮＧ：Ｔｈｉｓ ｃｙｔｏｌｏｇｙ／ｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｅｘｐｅｄｍｅｎｔ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｔ ｔｈｅ Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ Ａｕｇｕｓｔ ｔｏ
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００５．
ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ：Ｆｉｖｅ ＳＰＦ ｇｒａｄｅ ｆｅｍａｌｅ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ，ａｇｅｄ ３－ｍｏｎｔｈｓ ｏＩｄ，ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ １４ ｄａｙｓ．
ＭＡＩＮ ＯＵＴｃｏＭＥ ＭＥＡＳＵＲＥＳ：Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＢＭＳＣｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂＶ ｔｈｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ０ｆ ＢＭＳＣ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔａｒ．０ｓｔｅｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｖ ＯｊＩ ｒｅｄ Ｏ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ· ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ＢＭＳＣｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｈａｄ ｓｈｏｒｔｅｒ ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｆａｓｔｅｒ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｔ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐａｓｓａｇｅ，ＢＭＳＣｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ
酸酶染色罄定成骨能力，以油红Ｏ染色鉴定成脂能力，以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比。全骨髓贴肇法分离获得的骨髓间允质干细胞贴壁时间短，增殖快，经传代后能够纯化。第３
代骨髓间充质干细胞形态单一均匀。呈舆型的极性漩涡状牛长，不表达造血前体细胞标志抗原ＣＤ３４和自细胞标志抗原 ＣＤ４５，表达整合索家族成员ＣＤ２９和黏附分子ＣＤ４４，经诱导后碱性磷酸酶染色、油红Ｏ染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓ｆ’ＨＪ充质干细胞，效果优于密度梯度离心法。经伞骨髓贴壁法体外
ｔｙｐｉｃａｌ ｐｏｌａｒ ｓｗｉｒｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＢＭＳＣｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ ＣＤ３４ ａｎｄ ＣＤ４５。ｂｕｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＣＤ２９ ａｎｄ ＣＤ４４．Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｏｉｌ ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌｓ．
设计：细胞学体外对比观察。 时间及地点：于２００５—０８／１２在暨南大学完 成。 材料：ＳＰＦ级３月龄ＳＤ雌性大鼠５只，体质 量（２３０－１－１０）ｇ，由中山大学实验动物中心提 供，动物质量合格证号：粤监证字２００５Ａ０１０， 实验过程中对动物的处置符合１９８８年国家科 委《实验动物管理条例》的规定［３１。
摘要 背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞存组织－Ｔ程等领域应用广泛，建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要ａ 目的：以不Ｉ司方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。