02第二章___沉淀法
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污水处理中的化学沉淀法
维护和保养。
改进方向
研发低成本、高效的药剂
通过研发新型的化学药剂，降低处理成本，提高处理效率。
优化工艺参数
通过实验研究，优化加药量、反应时间、沉淀时间等工艺参数，提高 处理效果。
加强二次污染控制
采取措施减少化学药剂的残留和重金属离子的排放，降低二次污染的 风险。
沉淀物资源化利用
探索将化学沉淀法产生的沉淀物进行资源化利用的方法，如制作建筑 材料、肥料等，实现环境友好型的可持续发展。
03 化学沉淀法的优缺点分析
优点
01
02
03
04
高效性
化学沉淀法能够快速有效地去 除污水中的重金属和有害物质
，提高水质。
灵活性
针对不同种类的污染物，可以 通过选择合适的化学药剂来实
现高效处理。
操作简便
化学沉淀法的工艺流程相对简 单，易于实现自动化控制，降
低人工操作成本。
适用范围广
适用于各类工业废水、城市污 水及湖泊、河流等水域的治理
04 化学沉淀法与其他污水处理方法的比较
与生物处理法的比较
适用性
化学沉淀法适用于处理含有重金属、 氮、磷等污染物的污水，而生物处理 法主要适用于有机污染物的处理。
运行成本
生物处理法的运行成本相对较低，而 化学沉淀法需要使用化学药剂，因此 处理成本较高。
处理效果
生物处理法在去除有机污染物方面具 有较高的效率，但处理重金属等无机 污染物效果较差；化学沉淀法则对无 机污染物的去除效果较好。
处理效果
物理处理法的处理效果相对较低，通常作为其他处理方法 的预处理或辅助处理手段；化学沉淀法则具有较高的处理 效果，能够显著降低污染物浓度。
环境影响
物理处理法的环境影响较小，而化学沉淀法可能产生二次 污染。
改进方向
研发低成本、高效的药剂
通过研发新型的化学药剂，降低处理成本，提高处理效率。
优化工艺参数
通过实验研究，优化加药量、反应时间、沉淀时间等工艺参数，提高 处理效果。
加强二次污染控制
采取措施减少化学药剂的残留和重金属离子的排放，降低二次污染的 风险。
沉淀物资源化利用
探索将化学沉淀法产生的沉淀物进行资源化利用的方法，如制作建筑 材料、肥料等，实现环境友好型的可持续发展。
03 化学沉淀法的优缺点分析
优点
01
02
03
04
高效性
化学沉淀法能够快速有效地去 除污水中的重金属和有害物质
，提高水质。
灵活性
针对不同种类的污染物，可以 通过选择合适的化学药剂来实
现高效处理。
操作简便
化学沉淀法的工艺流程相对简 单，易于实现自动化控制，降
低人工操作成本。
适用范围广
适用于各类工业废水、城市污 水及湖泊、河流等水域的治理
04 化学沉淀法与其他污水处理方法的比较
与生物处理法的比较
适用性
化学沉淀法适用于处理含有重金属、 氮、磷等污染物的污水，而生物处理 法主要适用于有机污染物的处理。
运行成本
生物处理法的运行成本相对较低，而 化学沉淀法需要使用化学药剂，因此 处理成本较高。
处理效果
生物处理法在去除有机污染物方面具 有较高的效率，但处理重金属等无机 污染物效果较差；化学沉淀法则对无 机污染物的去除效果较好。
处理效果
物理处理法的处理效果相对较低，通常作为其他处理方法 的预处理或辅助处理手段；化学沉淀法则具有较高的处理 效果，能够显著降低污染物浓度。
环境影响
物理处理法的环境影响较小，而化学沉淀法可能产生二次 污染。
第二章 沉淀法
（六）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在 的某些杂蛋白变性沉淀而不影 响所需蛋白质的方法
（七）结晶
• 不同晶体沉淀性质＋盐或有机 溶剂使接近结晶物溶解度。 • 饱和度硫酸铵或刚出现混浊， 调节等电点，使温度下降 • 晶种。
常用的沉淀类型
蛋白质: • 盐析法 • 有机溶剂沉淀法 • 蛋白质沉淀法 • 聚乙二醇沉淀法 • 选择性沉淀法 • 结晶沉淀法 核酸步骤: DNP/RNP复合物的解聚→多糖等杂质的 消除→ DNA与RNA的分离→核酸沉淀
（一）盐析法
• 盐浓度增高到一定数值后， 水活性降低，导致蛋白质分子 表面电荷逐渐被中和，水化膜 相继被破坏，最终引起蛋白质 分子间相互聚集并从溶液中析 出。 • 常用盐：硫酸铵 少量多次缓慢加入 • 盐析的影响因子:蛋白质浓度, 离子强度和离子类型,pH,温度.
（四）蛋白质沉淀法
• 所用的试剂仅对一类或一种蛋 白质沉淀起作用。 • 常见试剂：碱性蛋白质,凝集 素和重金属等. • 碱性蛋白质：多价阳离子,除 能有效地沉淀核酸物质外,还 能沉淀某些蛋白质。 • 重金属沉淀法：在低温下进行 • 凝集素：与糖蛋白有明显凝集 作用。
（五）聚乙二醇沉淀法
• PEG和右旋糖苷硫酸钠等水溶 性非离子型聚合物可使蛋白质 发生沉淀作用.沉淀的条件温 和,不会引起蛋白质变性.
第二章
沉淀法
一、基本原理
• 根据各种物质的结构差异性
（蛋白质分子表面疏水和亲水 基团之间比例的差异性）来改
变溶液的某些性质（如pH，极
性，离子强度，金属离子等）
进而导致有效成分的溶解度发
生变化。
二、沉淀的类型
可逆沉淀反应:在温和条件下沉淀的蛋白质 可以重新溶解形成溶液。蛋白质胶体溶液的稳定性被破坏。 又称为非变性沉淀。 如：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法 不可逆沉淀反应：在剧烈条件下，沉淀的蛋白质不能再 重新溶解形成溶液。又称为变性沉淀。蛋白质胶体溶液 的稳定性不仅被破坏，且蛋白质的结构和性质也被破坏 了。 如：加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀
第 二 章 沉 淀 法
4.非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 4.非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。 非离子多聚体沉淀法 5.生成盐复合物沉淀：用于多种化合物， 5.生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别 生成盐复合物沉淀 是某些小分子物质的沉淀。 是某些小分子物质的沉淀。 6.热变性及酸碱变性沉淀法：即选择性变性沉 6.热变性及酸碱变性沉淀法： 热变性及酸碱变性沉淀法 在分离制备时， 淀。在分离制备时，选择性地用于除去某 些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋白。 pH值下易变性的杂蛋白 些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋白。
*饱和度概念：每升溶剂可溶解盐的量（克） 饱和度概念：每升溶剂可溶解盐的量（
* 饱和硫酸铵的配制在1升水中加入硫酸铵的 饱和硫酸铵的配制在1 量达到100 饱和度时，总体积为1.42L,克 100％ 1.42L, 量达到100％饱和度时，总体积为1.42L,克 分子浓度为4.1M/L.即在 4.1M/L.即在1 分子浓度为4.1M/L.即在1升水中含硫酸铵 的量g =4.1× 的量g＝ M×W×V =4.1×132 ×1.42=768g 根据工作表和经验公式计算某一蛋白质 溶液的硫酸铵饱和度时加入的量。 溶液的硫酸铵饱和度时加入的量。
蛋白质在不同 pH 时盐析机理
3、盐析法的优缺点 、
成本低，不需要特别昂贵的仪器设备。 成本低，不需要特别昂贵的仪器设备。 操作简单，安全。 操作简单，安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 对溶液中分离物的总浓度要求高（ mg/ml） 对溶液中分离物的总浓度要求高（2mg/ml）。 由于发生共沉淀现象，故分辨率不高。 由于发生共沉淀现象，故分辨率不高。
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
B. 加入饱和溶液法：适合于要求饱和度不高， 加入饱和溶液法：适合于要求饱和度不高， 而且原溶液体积不大时使用。 而且原溶液体积不大时使用。但对体积的 影响较大，在操作时仍应缓慢加入， 影响较大，在操作时仍应缓慢加入，以免 局部过浓，影响分离效果。 局部过浓，影响分离效果。 C. 透析平衡法：将需盐析的样品置透析袋中， 透析平衡法：将需盐析的样品置透析袋中， 浸入饱和的硫酸铵溶液中进行透析， 浸入饱和的硫酸铵溶液中进行透析，盐不 断地进入透析袋内， 断地进入透析袋内，逐步达到所需要的盐 析饱和度，使蛋白质产生沉淀即停止透析。 析饱和度，使蛋白质产生沉淀即停止透析。 其盐的变化是连续性的，盐析效果较好。 其盐的变化是连续性的，盐析效果较好。 但计算饱和度的测定工作手续繁琐。 但计算饱和度的测定工作手续繁琐。
第二章 沉淀法
法。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
7、沉淀法的优缺点
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、
选择性不强。
8、沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法；
（4）亲和沉淀法；
（5）选择性沉淀法。 （6）复合盐沉淀法； （7）非离子型聚合物沉淀法； （8）聚电解质沉淀法；
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
11、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
二、蛋白质的溶解特性
蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的 两性高分子电解质，形成荷电区。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量 高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。
亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面， 形成亲水区。
因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区。
三、盐析
Salt induced precipitation
1、定义
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋 白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级 中使用，得到了比较满意的结果。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需pH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化 已考虑在表中； 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
第二章 沉淀法..
（3）多价阳离子的作用 蛋白质和多价阳离子（如Zn2+和Cu2+等）能 结合形成复合物，使蛋白质在有机溶剂中的 溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀 的蛋白质特别有益。 例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.0050.02nmol/L Zn2+，就可大大减少有机溶剂的 用量，而将蛋白质沉淀出来。
三、 蛋白质沉淀剂
四、聚乙二醇沉淀作用
水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。
沉淀作用较满意的聚合物是分子量在400-6000之间的聚 乙二醇。 优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全， 应用范围广。 缺点：易受各种因子如pH、离子强度、蛋白质浓度及聚 合物分子量的影响。
五、选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子（如温度、 酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特 点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变 性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中 （或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效 成分的目的。
原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊 的可逆沉淀作用 优点：选择性较强，方法简单，种类较多
缺点：应用范围较窄 应用范围：各种生物大分子物质的沉淀
六、 结晶
—改变溶解度产生沉淀的方法
蛋白质沉淀：晶体沉淀和无定形沉淀 结晶过程是纯化过程。在提纯阶段，当某一纯蛋白质 溶液的浓度达到较高（5%-30%）水平时，若条件适合， 就能产生一定形状的结晶。当蛋白质溶液中混有杂质 时，即使条件适合，也得不到整齐的结晶，或无结晶 形成。 用显微镜观察结晶的有无及形状，为判断提纯物质纯 化程度的一种方法。
透析时注意：
（1）透析袋的处理
新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。 除去透析袋中所含盐类时，处理方法： 将透析袋置500毫升含1mmo1/L EDTA-Na2的2％碳酸氢钠 溶液中煮沸10分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸 馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后， 能重复使用。 保存：泡在蒸馏水中置低温（4℃）或泡在70％的乙醇中 保存。
第二章催化剂的制备-沉淀法
陈化胶凝
溶胶
（加胶溶剂）胶溶
干燥
焙烧
催化剂
金属醇盐胶溶法制备催化剂的Sol-Gel过程
Formation of a hydrogel
Aging of a hydrogel Solvent removal Heat treatment
Four main steps in the sol–gel preparation
浸渍法 离子交换法
催化剂的成型
1、沉淀法
在金属盐溶液中加入沉淀剂，生成 难溶金属盐或金属水合氧化物，从 溶液中沉淀出来，再经老化、过滤、 洗涤、干燥、焙烧、成型、活化等 工序制得催化剂或催化剂载体
—— 广泛用于制备高含量的非贵金属、 （非）金属氧化物催化剂或催化剂载体
沉淀法的生产流程
形成沉淀的条件
关键：瞬间混合—快速搅拌
Ni(NO3)2 + HNO3溶液 = 1.1
NaNO3溶液 = 1.2
Na2SiO3溶液 = 1.3
（防止形成结构或组成不均匀的沉淀） Ni/SiO2制备 （苯选择加氢 催化剂） 形成均匀的水溶胶或胶冻， 再经分离、洗涤、干燥、焙
烧、还原即得催化剂
导晶沉淀法 借助晶化导向剂（晶种）引导非晶型沉淀转化为晶型沉淀 的快速有效方法 — 预加少量晶种引导结晶快速完整形成 例：制备高硅钠型分子筛（丝光沸石、X型、Y型分子筛）
沉淀剂不直接加入待沉淀溶液中，而是首先把待沉淀溶液 与沉淀剂母体混合，形成一个十分均匀的体系，然后调节 温度，使沉淀剂母体逐步转化为沉淀剂，从而使沉淀缓慢 进行，得到均匀纯净的沉淀物
例：制取氢氧化铝沉淀
(NH2)2CO +
3H2O
90～100℃ 2NH4+
分离科学与技术第2章 沉淀分离法
第二章 沉淀分离法
2.2 沉淀的生成过程 2.2.5 分级沉淀 分级沉淀：两种难溶盐（阳离子或阴离子相同），若 其溶度积相差足够大时，可通过加入沉淀剂将其先后分 别沉淀出来加以分离。 溶度积小的难溶盐先沉淀，如 AgI 较 AgCl 先沉淀。
第二章 沉淀分离法
2.2 沉淀的生成过程 2.2.5 分级沉淀
第二章 沉淀分离法
2.2 沉淀的生成过程 2.2.4 晶形沉淀与胶体 内因： 沉淀的性质
生成沉淀类型 外因
沉淀的形成条件
沉淀的后处理
沉淀类型：晶形沉淀、无定形沉淀、凝乳状沉淀
几种类型沉淀的比较 特点 直径 晶形沉淀 0.1~1 m 凝乳状沉淀 0.02~0.1 m 无定形沉淀 < 0.02 m
[I ] [Cl ] 6 6 10 , 10 [Cl ] [I ]
Ksp,AgI = [Ag+][I] = 9.31017 Ksp,AgCl = [Ag+][Cl] = 1.81010 当 [Cl]/[I] < 106 时，只有 AgI 析出； 当 [Cl]/[I] > 106 时，AgCl 才开始析出。
第二章 沉淀分离法
2.1 沉淀生成的条件 2.1.3 氢离子浓度及配位剂的影响 配位剂的影响： 难溶盐沉淀 + 配位剂 溶解度增大（或完全溶解）
第二章 沉淀分离法
2.1 沉淀生成的条件 2.1.4 有机溶剂的影响 有机溶剂的影响： 难溶盐沉淀 + 有机溶剂 溶解度减小（溶剂化作用较 小，介电常数较低）。如 PbSO4: 100 mL H2O: 4.0 mg, 100 mL 20% 乙醇: 4.0/10 mg 100 mL 乙醇: 4.0/1500 mg
第二章 沉淀分离法
第二章-沉淀
从实验室小试到一定规模的生产实用化， 还须解决沉淀过程的放大。为保持产物 分离或纯化的收率， 设备放大后尽可能 维持小试过程的动力学。沉淀分离操作 中，搅拌混合有重要影响。沉淀操作的 规模放大一般以单位体积输入功率为基 准， 在放大时保持单位体积的输入功率P ／V不变。
热 沉 淀
在较高温度下，热稳定性差的蛋白质将发生变性沉淀， 因此，可根据蛋白质间热稳定性的差别进行蛋白质的热 沉淀(Thermal precipitation)，分离纯化热稳定性高的目标 产物。
变性活化能差别较大的蛋白质可利用热沉淀法分离。由
于变性活化能可通过调节pH或添加有机溶剂改变，故调 节pH或添加有机溶剂是诱使杂蛋白变性沉淀的重要手段
阴离子的盐析作用顺序为:
P03—4> S02—4 >CHC00—>CI—>N03—>C104->I->SCN阳离子的盐析作用的顺序为
NH+4 >K+>Na+>Mg2+
温度和pH对蛋白质溶解度的影响反映在 Cohn方程中是对β值的影响。在高离子强度溶
液中，升高温度有利于某些蛋白质的失水，因
而温度升高，蛋白质的溶解度下降。而在低离 子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定 温度范围内一般随温度升高而增大。 在pH接近蛋白质等Fra bibliotek点的溶液中蛋白质的
V (% ) 1 .8 0 .1 2 ln M
盐析沉淀
• 原理 • 影响盐析的因素
• 盐析操作
盐析原理 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发 生沉淀的现象称为盐析(Salting-out)。当离子强度较 高时，溶解度的对数与离子强度之间呈线性关系， 用Cohn经验方程描述：
第二章 沉淀分离法
Fe3+、Cr3+、Ce4+ 、 Be2+、Cu2+、 Ti4+、Zr4+、Hf4+、 Ag+、 Hg2+、 Bi3+、Sn4+、V (Ⅵ) Pb2+ 、 Sb3+、 U(Ⅳ) 、 Nb(Ⅴ) Sn2+、Mo (Ⅵ) Ta(Ⅴ) 、W(Ⅵ)等 V (Ⅴ) 、 U (Ⅵ) Au (Ⅲ) 、稀土等
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二、沉淀分离法的特点
（characteristic of precipitation method）
三、沉淀的类型与形成条件
（types of precipitation and their formation conditions）
四、无机沉淀剂沉淀法
（inorganic precipitator ）
----使某些高价Mn+沉淀 其它微溶性碳酸盐或氧化物的悬浊液, 如:BaCO3、CaCO3、PbCO3、MgO的悬浊液具 有同样的功效，仅控制的pH范围各不相同而已。 HAc-NaAc也能达到同样的效果.
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第一节 沉淀分离法
原理: ZnO + H2O Zn2+ +2OHZn(OH)2
因此，控制[H+]即可控制[S2-] 。
常见阳离子： 2+ Hg 2+ Pb + 3+ Ag Fe As(Ⅲ,Ⅴ) 3+ Bi 3+ Al Sb ( Ⅲ , Ⅴ ) 2+ Cu 2+ 3+ Hg2 Cr Sn( Ⅱ , Ⅳ ) 2+ Cd Ⅰ Ⅱ Ⅲ
0.3mol/L[H+] l硫化物沉淀
第二章沉淀分离法
第二章 沉淀分离法沉淀分离(separation by precipitation)法是在试液中加入适当的沉淀剂，使某一成分以一定组成的固相析出，经过滤而与液相相分离的方法。
沉淀分离法是一种经典的化学分离方法，该法需经过过滤、洗涤等步骤，操作较为烦琐费时，但通过改进分离操作，使用选择性较好的沉淀剂，可以加快分离速度，提高分离效率，因此至今仍得到广泛的应用。
本章主要介绍无机沉淀剂分离法、有机沉淀剂分离法、均相沉淀分离法和共沉淀分离法四类方法。
§2-1 无机沉淀剂分离法一些离子的氢氧化物、硫化物、硫酸盐、碳酸盐、草酸盐、磷酸盐、铬酸盐和卤化物等具有较小的溶解度，借此可以进行沉淀分离。
另外还有一些离子可以被还原为金属单质而被沉淀分离开。
一、沉淀为氢氧化物1．氢氧化物沉淀与溶液pH 值的关系可以形成氢氧化物沉淀的离子种类很多，根据各种氢氧化物的溶度积，可以大致计算出各种金属离子开始析出沉淀时的pH 值。
例如Fe(OH)3的K sp =4×10-38，若[Fe 3+]=0.010mol.L -1，欲使Fe(OH)3析出沉淀，则必须满足以下条件：383104]][[⨯>-+OH Fe010.0104][383--⨯>OH112.106.1][---⨯>L mol OH8.11<pOH 2.2>pH由此可见，欲使0.010mol.L -1 Fe 3+析出Fe(OH)3沉淀溶液的pH 值应大于2.2。
当溶液中残留的Fe 3+的浓度为10-6 mol.L -1时，即99.99%的Fe 3+已被沉淀，可以认为沉淀已经完全，此时的pH 值为：第二章 沉淀分离法1113638.104.310100.4][-----⨯=⨯=L mol OH 5.10=pOH 5.3=pH根据类似的计算，可以得到各种氢氧化物开始沉淀和沉淀完全时的pH 值，但是这种由K sp 计算得到的pH 值只是近似值，与实际进行氢氧化物沉淀分离时所需控制的pH 值往往还存在一定的差异，这是因为：（1）沉淀的溶解度和析出的沉淀的形态、颗粒大小等条件有关，也随陈化时间的不同而改变。
第二章 沉淀法
。
②硫酸铵盐析
A.固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定 的饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 B.饱和溶液法：逐步加入预先调好pH值的饱和硫酸铵， 蛋白质便可沉淀出来。 C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过 透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质 。
A.固体法
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对 于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加 入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达 到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中， 通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度， 沉淀蛋白质。
此法仅在要求较精确、样品体积小的试验使用。
注意事项 (1)低温下操作 防止有机溶剂的放热使蛋白变性
(2)中性盐作用
增加蛋白质溶解度，防变性
结合蛋白质，致其溶解度降低
(3)多价阳离子作用
3．蛋白质沉淀法
蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉淀起 作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。 (1)碱性蛋白质：如鱼精蛋白，除能有效地沉淀核酸物质外， 还能沉淀某些蛋白质。当把鱼精蛋白加入部分纯化的酵母磷 酸果糖激酶溶液时，溶液中的酶蛋白便吸附到鱼精蛋白核酸 沉淀物上。沉淀物用磷酸缓冲液洗脱后，收得的磷酸果糖激 酶的纯度比原来提高了9倍。
5. 选择性沉淀法
6. 结晶沉淀法
（一）盐析法
原理：高浓度中性盐存在下，使生物分子在水溶液中溶解
的溶解度降低而产生沉淀的方法，多用于蛋白质（酶）的
分离。 常用的盐类是硫酸铵。 优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
第2章 沉淀法..
2018/9/14
海南大学农学院wss10
4)非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分
子。
5)生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特
别是某些小分子物质的沉淀。
6)热变性及酸碱变性沉淀法：即选择性变性
沉淀。在分离制备时，选择性的用于除去
某些不耐热及在一定pH值下易变性的杂蛋 白。
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一般控制样品液蛋白浓度在0.2%～2％为宜。 长短的控制。
5.其他： 如 EDTA、EGTA等金属离子螯合剂; 时间
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（六）脱盐
方法：凝胶过滤法
透析法
透析法的原理是基于分子的扩散运动，具体操
3.为保证实验的重复性，应严格控制盐析条件的 pH、温度和盐的纯度。
4.盐析后需静置1小时以上沉淀完全后才进行过 滤或离心。
5.盐析时的搅拌必须是有规则的和温和的。 6.为平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉 淀反应至少应在50 mmol/L缓冲液中进行。
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2.盐分级范围的差异性 与蛋白质的盐析分离效果
沉淀量/mg
A
B
C
30
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40
50
60
70
80
90 硫酸铵饱和度/％
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3.pH和盐浓度
在pI附近可用合适的盐浓度改变蛋白质的溶解度。
4.蛋白质的纯度和浓度
蛋白质存在的形式（均一的还是混合的）和浓度不 同，盐析范围和溶解度也不同。 蛋白质浓度高时共沉淀明显，盐析效果差。
第二章-沉淀法
沉淀法
3.3 DNA与RNA的分离
3.3.1 盐析法 利用：DNA与RNA在不同NaCl溶液中溶解度不同 DNA：在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较大；
在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度极小。
RNA： 在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度较大； 在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较小。
使分层明显； 残留的酚、氯仿用乙醚萃取去除，残留乙醚68°C蒸馏去
除。
沉淀法
3.1.3 加蛋白水解酶
• 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E • 蛋白酶E中含DNase，用前80°C，5min，或
37°C温育0.5~1hr.
沉淀法
3.2 消除多糖杂质
• 选用选择型沉淀剂：异戊醇、十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)
沉淀法
2.4.2 有利于结晶的措施 加少量“晶种”； 适当搅拌。
沉淀法
小结：蛋白质沉淀法
• 盐析法：机理 方法：固体法、饱和溶液法、透析法 影响因素：Ks、pH、纯度、浓度等
有机溶剂法：操作注意点
聚乙二醇法：分子量
结晶法：
沉淀法
第三节 核酸的制备
• 思路：从生物材料中分离出DNA-protein（DNP） 或RNA_protein（RNP)－－－解聚－－－去除蛋 白质－－－沉淀核酸
沉淀法
C、蛋白质纯度和浓度的影响： D、其他因素的影响： 金属离子：加EDTA－Na2溶液 加（NH4)2SO4时间：2hr加完
沉淀法
5) 脱盐
• 凝胶过滤法： • 透析法： 透析方法：
搅拌下，3hr平衡，样品液：透析液＝1:10； 或静止，过夜，样品液：透析液＝1:20。
沉淀法
2.2 有机溶剂沉淀法
3.3 DNA与RNA的分离
3.3.1 盐析法 利用：DNA与RNA在不同NaCl溶液中溶解度不同 DNA：在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较大；
在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度极小。
RNA： 在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度较大； 在1－2mol/L NaCl溶液中溶解度较小。
使分层明显； 残留的酚、氯仿用乙醚萃取去除，残留乙醚68°C蒸馏去
除。
沉淀法
3.1.3 加蛋白水解酶
• 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E • 蛋白酶E中含DNase，用前80°C，5min，或
37°C温育0.5~1hr.
沉淀法
3.2 消除多糖杂质
• 选用选择型沉淀剂：异戊醇、十六烷基三甲基溴 化铵（CTAB)
沉淀法
2.4.2 有利于结晶的措施 加少量“晶种”； 适当搅拌。
沉淀法
小结：蛋白质沉淀法
• 盐析法：机理 方法：固体法、饱和溶液法、透析法 影响因素：Ks、pH、纯度、浓度等
有机溶剂法：操作注意点
聚乙二醇法：分子量
结晶法：
沉淀法
第三节 核酸的制备
• 思路：从生物材料中分离出DNA-protein（DNP） 或RNA_protein（RNP)－－－解聚－－－去除蛋 白质－－－沉淀核酸
沉淀法
C、蛋白质纯度和浓度的影响： D、其他因素的影响： 金属离子：加EDTA－Na2溶液 加（NH4)2SO4时间：2hr加完
沉淀法
5) 脱盐
• 凝胶过滤法： • 透析法： 透析方法：
搅拌下，3hr平衡，样品液：透析液＝1:10； 或静止，过夜，样品液：透析液＝1:20。
沉淀法
2.2 有机溶剂沉淀法
化学 盐析沉淀法
一、盐析沉淀法
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
（2）缺点：
① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能 直接用于医药上
盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精 制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析 等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
_ _ _ _ _ _ _ _ _
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5
50
60
盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。
（2）缺点：
① 沉淀物中含有大量盐析剂 ② 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能 直接用于医药上
盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精 制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析 等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。
阳离子对盐析效果的影响：
Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产
(分批加入，充分搅拌)
加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产
_ _ _ _ _ _ _ _ _
蛋白质的盐析机制示意图
蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。
2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5
50
60
第二章 沉淀与共沉淀
第二章沉淀与共沉淀第一节基本概念最古老的化学分离方法是沉淀法，由Fresenius提出并由Treadwell在其1899年出版的著作中加以推广的经典定性分析法，就是以沉淀法为基础的。
一、常量组分的沉淀分离常量组分微量组分c9c10幻灯片 3c9 cht, 2006-6-14 c10 cht, 2006-6-14二、微量组分的共沉淀分离和富集第二节原理第节原一.沉淀类型胶状沉淀2.胶状沉淀2.相互吸引的范德华力相互排斥的双电层力3.共沉淀混晶的形成、吸藏和吸附。
幻灯片 10c3 cht, 2006-6-14影响共沉淀的因素主沉淀和共沉物质第三节沉淀和共沉淀在分离富集中的应用对沉淀反应的要求：所生成的沉淀溶解度小纯度高稳定所生成的沉淀溶解度小、纯度高、稳定幻灯片 13c4 cht, 2006-6-14常用的沉淀分离方法氢氧化物、硫化物、其它沉淀剂草酸、铜试剂铜试剂、、铜铁试剂S C 2H 5N-ONH 4NSNaC 2H 5N=O铜试剂铜铁试剂（1）无机沉淀剂氢氧化物沉淀分离NaOH pH=14(1) 主要用于两性元素与非两性元素分离。
N O过量p()主要用于两性元素与非两性元素分离2+2+Mn、Ni10(2)Be2+3+3+2+稀土10 (2) Be、Al、Fe、Cr、稀土、Ti（IV）、Mg2(pH=12—12.5)、M2+(H12125)机碱吡啶机碱：吡啶、pH=5—6Sn（IV）、Sn2+、Fe3+、Bi3+、Sb（III）、Zn2+ ZnO悬浊(微溶碳酸盐或氧化物：MgO, BaCO3, CaCO3,*加入NHCl的作用：4金属氢氧化物开始沉淀与完全沉淀的值（设金属离子的浓度为001mol/L pH 值（设金属离子的浓度为：0.01mol/L）氢氧化物开始沉淀pH 值沉淀完全pH 值氢氧化物开始沉淀pH 值沉淀完全pH 值H 2WO 400Zn （OH ）26.48.5Sn （OH ）40.51稀土氢氧化物6.8-8.5-9.5TiO （OH ）20.5 2.0Pb （OH ）27.28.7Ge （OH ）40.8 1.2Ag 2O 8.211.2ZrO （OH ）2 2.3 3.8Fe （OH ）27.59.7F 2341C 7682Fe （OH ）3 2.3 4.1Co（OH ）27.68.2Al （OH ）3 4.0 5.2Ni （OH ）27.78.4Th （OH ） 4.5Cd （OH ）8.28.742Cr （OH ）3 4.9 5.9Mn （OH ）28.810.4Be （OH ）26.2 6.8Mg （OH ）210.412.4c5氢氧化物沉淀分离的特点:氢氧化物沉淀为胶体沉淀，选择性差,共沉淀严重，影响分离效果。
催化剂工程导论02
• 5) 制溶胶用1：1HNO3， 控制PH=3.9～4.4，溶胶 粘度3ml/65s合格。
•
6) 烃氨柱构成：
• 煤油柱： 20～30cm高/D：2cm
• 油酸钠： 少量
• 15%氨水柱：80～70cm高/D：2cm.
• 二、工艺说明： • 1、原料选择：
A. 所选原料必须有一定纯度，对某些有害杂 质，必须控制在一定水平以下。
• 2）沉淀反应条件：pH=8.5～9.2;
温度: 85±2℃.
• 3) 老化温度85±5℃, 时间1小时.
• 4) 洗涤（打浆）： 水/沉淀（滤饼）=30:1，温度 85℃， 时间0.5小时，2～3,4次。 0.1N AgNO3检 验Cl-离子，合格。（无絮状AgCl白色沉淀，静置 2 ～ 3分钟，仍不见沉淀。）
• 分类：
•
单组分沉淀：γ-Al2O3，α-Al2O3等
• 酸法：以碱为沉淀剂，从酸性盐（常用无
水氯化铝）溶液中沉淀金属水合物；碱法：
以酸为沉淀剂，从金属酸盐（如偏铝酸盐）
溶液中沉淀金属水合物。
•
共沉淀（多组分共沉淀）CuO-ZnO-
Al2O3，三种硝酸盐，Na2CO3并流加入。
•
均匀沉淀法 尿素水解释放出OH-
～70℃
趁热过滤
• 老化
洗涤（打浆）
～70℃
• 溶胶
烃氨柱 成球
老化（45分钟）
• 漂洗 干燥 焙烧 得成品γ- Al2O3。 • 干燥条件：105℃ ，3小时
，即
焙烧条件：500 ℃ ，4小时。
• 备注：1）采用并流，即并加。[顺加（B
加入A）会先后沉淀（多组 分）；逆加（A加入B）pH值 改变。]
PH值，加料方式，搅拌强度） • 3. 陈化洗涤 • 4. 干燥焙烧和活化
第二章沉淀法
第二章沉淀法
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
第二章沉淀法
(1)去污剂
在破细胞的溶液中， ➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白
和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 ➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
第二章沉淀法
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
第二章沉淀法
以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
第二章沉淀法
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
第二章沉淀法
盐析小结
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）； C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
第二章沉淀法
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
白质及SDS-K+等物质； ➢ 接着可采用离心方法将沉淀物除去，上清液即为初步纯化的
核酸制品。
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
第二章沉淀法
(1)去污剂
在破细胞的溶液中， ➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白
和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。 ➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
第二章沉淀法
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
第二章沉淀法
以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
第二章沉淀法
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
第二章沉淀法
盐析小结
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）； C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
第二章沉淀法
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
白质及SDS-K+等物质； ➢ 接着可采用离心方法将沉淀物除去，上清液即为初步纯化的
核酸制品。
化学 盐析沉淀法
2.5 2.0
1.5 lgS 1.0
0.5
起始蛋白
0
浓度
-0.5
-1.0
-1.5
β
盐溶
碳氧血红蛋白的lgS
与(NH4)2SO4离子强 度μ的关系
S0
盐析
1 234 56 μ(离子强度)
盐析区: lgS = β - Ks μ
蛋白质溶解度 常数 盐析常数 盐离子强度
7
（二）无机盐的选择
在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,
一、盐析沉淀法 盐析法：
在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。
早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质（酶）等生物大分子物质。
1
（一）基本原理
蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。
2
0 20 30 40 50 60 70 P
蛋白质溶解度随(NH4)2SO4
饱和度而变化的速率
16
2.蛋白质浓度的影响 蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。 随浓度提高，盐用量减少。
8 – d—S 6
dP 4 2
30g/L
3g/L
分级沉淀： 将溶液稀释，使重 叠曲线拉开距离
制取成品： 提高蛋白质浓度
+ + 中和电荷
+ + + ++ SO42-
_+
+_ +
+ __ _+
中性盐 中和电荷
_ _
_
__
NH4+ _
或Na+
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➢ 接着可采用离心方法将沉淀物除去，上清液即为初步纯化的 核酸制品。
(2)有机溶剂
有机溶剂如苯酚、氯仿是蛋白质的一类变性剂。 用变性剂反复处理抽提溶液， 直至处理液经离心后，在上层水相(含核酸)和下层有 机相之间的界面处(含变性凝聚蛋白)无变性蛋白为止。 收集上层水相， 用透析法除去残留的酚和氯仿即为核酸制品。
(2)盐析曲线制作
用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确 定。
具体步骤如下：
A. 分级沉淀
取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH 至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵：
第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间， 离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。
接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第 二个分级沉淀部分。
如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中，
根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图，
即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
C.确定最佳盐析范围
在此曲线基础上，参照表2-3的分级试验方法，可根据生物 材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和收得率的需求， 先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致分级框架，然后经 过反复试验就能确定最佳盐析范围。
结构差异：如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比 例的差异 某些性质：如pH、极性、离子强度、金属离子等 换句话说就是： 不同的物质置入相同的溶液，溶解度是不同的； 相同的物质置人不同的溶液，溶解度也是不同 的。
二、制备蛋白质
1．盐析法
盐析法的根据是：
蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上 升(盐溶salting in)， 但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降， 直至蛋白质析出(盐析salting out)。
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达 55％时，尿素酶几乎全都沉淀出来(见表2-1)。
欲将蛋白质溶液变成一定饱和度硫酸铵溶液时，需要加 入的硫酸铵数量可从表2-2（P25）查得，
也可用下列公式计算：
(2)DNA与RNA的分离 ①盐析法
在提取DNA时，RNA属杂质；反之，DNA是杂质。 这两种核酸通常可用盐析法分开。
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）；
C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
实验证明，每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的 盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(S，以mg／ml表 示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可 用下面的公式表示：
V表示加入有机溶剂的体积；
Vo表示蛋白溶液的原始体积；
S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)； S度2表)。示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓
有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法 的注意事项在这里同样适用。
此外，还有几点需要指出：
(1)低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋
式中，V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)； Vo表示原来溶剂的体积(ml)； S2表示要求达到的百分饱和度； S1表示原溶液中的百分饱和度； S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百的)。
C．透析法
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体 积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液 中的盐浓度。
(3)蛋白水解酶
用酶法除去DNP／RNP复合物中的蛋白质组分的操作 比较温和，并可避免剪切和破坏核酸的现象发生。
常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K(见第一章)和蛋白 酶E(水解能力同蛋白酶K)。
2．多糖等杂质的消除
(1)多糖
混杂于核酸提取液的多糖类物质， 一般可用选择性沉淀剂如：异丙醇、十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB，适用于酸性多糖)即可达到目的。 此外，还可用等体积2.5mol／L磷酸缓冲液和等体积 乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于中部，核酸存在 于上层乙二醇甲醚中
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
(1)去污剂
在破细胞的溶液中，
➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白 和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。
➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋 白质及SDS-K+等物质；
凝集素中研究较清楚的有植物血球凝集素。它是一 种特殊的蛋白质。该物质对糖蛋白中糖链的末端序列 具有明显、特异的凝集力。
(3)重金属
重金属盐(如铅盐、汞盐)作为蛋白质沉淀剂，也能将 蛋白质或酶得到纯化。
4．聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和右旋糖酐硫酸 钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
3．蛋白质沉淀法
上面叙述的盐沉淀法和有机溶剂沉淀法是对很多蛋白 质沉淀都有效的方法。 蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉 淀起作用，
常见的有： 碱性蛋白质、 凝集素、 重金属等。
(1)碱性蛋白质
多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效 地沉淀核酸物质外，还能沉淀某些蛋白质。
(2)凝集素
上清液即为热稳定的醇脱氢酶溶液。
6．结晶沉淀法
蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形(非晶体)沉淀两 大类，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则。
蛋白质结晶形成过程，实际上也是一种纯化过程。
用显微镜观察结晶的有无及形状，也可作为判断提 纯物质纯化程度的一种方法。
结晶实质上是在特定条件下，改变溶解度产生沉淀 的一种方法。
Honing等的试验表明：沉淀作用较满意的是分子质量 在400—6000Da之间的聚乙二醇。 这种沉淀的条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉
淀较完全，因此应用范围颇广。
5．选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子(如：温度、酸碱度、 有机溶剂等)作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法，即 可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中 (或者发生可逆性沉淀)，从而达到纯化有效成分的目的。 例如：改变温度的选择性沉淀法从酵母菌细胞中纯化醇脱氢 酶 即酵母干粉中加0.066mol／L 磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液， 升温至55℃，保持20min后迅速冷却，离心去除热变性蛋白，
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。Fra bibliotek(4)脱盐
常用的脱盐方法：凝胶过滤法、透析法。 (前者的原理及操作将在第六章阐述)， 透析法的原理是分子扩散运动。
(1)盐分级沉淀
①盐的选择 常选用的盐是硫酸铵。 因为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，
有以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
第二编 纯化方法
主要讲解分离蛋白质和核酸等物质的常见方法
第二章 沉淀法
沉淀法是纯化生命大分子物质常用的一种经典 方法。该法操作简单、成本低廉。
一般包括：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
等类型。
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理
沉淀法也称溶解度法
纯化基本原理是： 根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质，就能致 使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。
g：表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数； S2：表示要求达到的百分饱和度。 S1：表示原溶液中的百分饱和度。
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法。 其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵
溶液。 不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算：
V=V0 [（S2-S1）/（S3-S2）]
③pH和盐浓度
一般来说， 在第一次盐析时(即除去杂质)，盐溶液pH应偏离有效 成分的pH值，靠近杂质的pH值； 在第二次盐析时(分级盐析范围内，即沉淀有效成分)， 盐溶液pH应调至接近有效成分的pH值。 另，考虑避免盐溶液pH值对蛋白质的破坏。
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
某一蛋白质的KS值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且也会 受溶液的pH、温度和盐的种类等因子的影响。
②盐分级范围的差异性
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的KS值都很大， 而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好(见图2-2 中A和C)；若KS值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果 不好(见图2-2中A和B)。
lgS=β- KS·M
式中，S表示有效成分在水中的溶解度；
M表示摩尔浓度；
KS表示有效成分在特定条件下的恒定值
(见表2-4)，其大小即表示有效成分之溶
解度降低的速率与盐浓度的关系。
KS值大，则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度 的增加而快速降低(即沉淀加快)。
因此，对一种有效成分而言，KS值越大，分级范围越窄，盐 析效果就越好。
(2)有机溶剂
有机溶剂如苯酚、氯仿是蛋白质的一类变性剂。 用变性剂反复处理抽提溶液， 直至处理液经离心后，在上层水相(含核酸)和下层有 机相之间的界面处(含变性凝聚蛋白)无变性蛋白为止。 收集上层水相， 用透析法除去残留的酚和氯仿即为核酸制品。
(2)盐析曲线制作
用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确 定。
具体步骤如下：
A. 分级沉淀
取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH 至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵：
第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间， 离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。
接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第 二个分级沉淀部分。
如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中，
根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图，
即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
C.确定最佳盐析范围
在此曲线基础上，参照表2-3的分级试验方法，可根据生物 材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和收得率的需求， 先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致分级框架，然后经 过反复试验就能确定最佳盐析范围。
结构差异：如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比 例的差异 某些性质：如pH、极性、离子强度、金属离子等 换句话说就是： 不同的物质置入相同的溶液，溶解度是不同的； 相同的物质置人不同的溶液，溶解度也是不同 的。
二、制备蛋白质
1．盐析法
盐析法的根据是：
蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上 升(盐溶salting in)， 但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降， 直至蛋白质析出(盐析salting out)。
到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。 例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度
达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达 55％时，尿素酶几乎全都沉淀出来(见表2-1)。
欲将蛋白质溶液变成一定饱和度硫酸铵溶液时，需要加 入的硫酸铵数量可从表2-2（P25）查得，
也可用下列公式计算：
(2)DNA与RNA的分离 ①盐析法
在提取DNA时，RNA属杂质；反之，DNA是杂质。 这两种核酸通常可用盐析法分开。
A.分级沉淀； B.作图盐析曲线：
测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含 量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）；
C.确定最佳盐析范围： 反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有 效成分纯度和收得率的需求）。
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
实验证明，每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的 盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(S，以mg／ml表 示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可 用下面的公式表示：
V表示加入有机溶剂的体积；
Vo表示蛋白溶液的原始体积；
S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)； S度2表)。示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓
有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。盐析法 的注意事项在这里同样适用。
此外，还有几点需要指出：
(1)低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋
式中，V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)； Vo表示原来溶剂的体积(ml)； S2表示要求达到的百分饱和度； S1表示原溶液中的百分饱和度； S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百的)。
C．透析法
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体 积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液 中的盐浓度。
(3)蛋白水解酶
用酶法除去DNP／RNP复合物中的蛋白质组分的操作 比较温和，并可避免剪切和破坏核酸的现象发生。
常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶K(见第一章)和蛋白 酶E(水解能力同蛋白酶K)。
2．多糖等杂质的消除
(1)多糖
混杂于核酸提取液的多糖类物质， 一般可用选择性沉淀剂如：异丙醇、十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB，适用于酸性多糖)即可达到目的。 此外，还可用等体积2.5mol／L磷酸缓冲液和等体积 乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于中部，核酸存在 于上层乙二醇甲醚中
常用有机溶剂： 苯酚、氯仿 为蛋白质的一类变性剂。
常用蛋白质水解酶： 溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E
(1)去污剂
在破细胞的溶液中，
➢ 加入适量的阴离子去污剂 SDS或其他去污剂,有利于使膜蛋白 和脂肪溶解，将DNP／RNP复合物解聚，进而释放出核酸。
➢ 随后加入适量的乙酸钾溶液，以沉淀核酸抽提液中的SDS-蛋 白质及SDS-K+等物质；
凝集素中研究较清楚的有植物血球凝集素。它是一 种特殊的蛋白质。该物质对糖蛋白中糖链的末端序列 具有明显、特异的凝集力。
(3)重金属
重金属盐(如铅盐、汞盐)作为蛋白质沉淀剂，也能将 蛋白质或酶得到纯化。
4．聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和右旋糖酐硫酸 钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
3．蛋白质沉淀法
上面叙述的盐沉淀法和有机溶剂沉淀法是对很多蛋白 质沉淀都有效的方法。 蛋白质沉淀法所用的试剂则仅对一类或一种蛋白质沉 淀起作用，
常见的有： 碱性蛋白质、 凝集素、 重金属等。
(1)碱性蛋白质
多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效 地沉淀核酸物质外，还能沉淀某些蛋白质。
(2)凝集素
上清液即为热稳定的醇脱氢酶溶液。
6．结晶沉淀法
蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形(非晶体)沉淀两 大类，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则。
蛋白质结晶形成过程，实际上也是一种纯化过程。
用显微镜观察结晶的有无及形状，也可作为判断提 纯物质纯化程度的一种方法。
结晶实质上是在特定条件下，改变溶解度产生沉淀 的一种方法。
Honing等的试验表明：沉淀作用较满意的是分子质量 在400—6000Da之间的聚乙二醇。 这种沉淀的条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉
淀较完全，因此应用范围颇广。
5．选择性沉淀法
根据各种蛋白质在不同物理化学因子(如：温度、酸碱度、 有机溶剂等)作用下稳定性不同的特点，用选择性沉淀法，即 可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中 (或者发生可逆性沉淀)，从而达到纯化有效成分的目的。 例如：改变温度的选择性沉淀法从酵母菌细胞中纯化醇脱氢 酶 即酵母干粉中加0.066mol／L 磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2h，室温搅拌3h，离心收集上清液， 升温至55℃，保持20min后迅速冷却，离心去除热变性蛋白，
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。
再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。Fra bibliotek(4)脱盐
常用的脱盐方法：凝胶过滤法、透析法。 (前者的原理及操作将在第六章阐述)， 透析法的原理是分子扩散运动。
(1)盐分级沉淀
①盐的选择 常选用的盐是硫酸铵。 因为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，
有以下优点： 溶解度大，对温度不敏感。 分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。 价格低廉，废液可以肥田。
缺点：得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
②硫酸铵盐析
A．固体法 在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加
第二编 纯化方法
主要讲解分离蛋白质和核酸等物质的常见方法
第二章 沉淀法
沉淀法是纯化生命大分子物质常用的一种经典 方法。该法操作简单、成本低廉。
一般包括：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
等类型。
第一节 基本原理与沉淀类型
一、基本原理
沉淀法也称溶解度法
纯化基本原理是： 根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质，就能致 使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。
g：表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数； S2：表示要求达到的百分饱和度。 S1：表示原溶液中的百分饱和度。
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法。 其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵
溶液。 不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算：
V=V0 [（S2-S1）/（S3-S2）]
③pH和盐浓度
一般来说， 在第一次盐析时(即除去杂质)，盐溶液pH应偏离有效 成分的pH值，靠近杂质的pH值； 在第二次盐析时(分级盐析范围内，即沉淀有效成分)， 盐溶液pH应调至接近有效成分的pH值。 另，考虑避免盐溶液pH值对蛋白质的破坏。
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显）
某一蛋白质的KS值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且也会 受溶液的pH、温度和盐的种类等因子的影响。
②盐分级范围的差异性
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的KS值都很大， 而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好(见图2-2 中A和C)；若KS值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果 不好(见图2-2中A和B)。
lgS=β- KS·M
式中，S表示有效成分在水中的溶解度；
M表示摩尔浓度；
KS表示有效成分在特定条件下的恒定值
(见表2-4)，其大小即表示有效成分之溶
解度降低的速率与盐浓度的关系。
KS值大，则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度 的增加而快速降低(即沉淀加快)。
因此，对一种有效成分而言，KS值越大，分级范围越窄，盐 析效果就越好。