氧化苦参碱预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护作用及其机制研究_周隆书_赵国龙_李

［4 ］ 药物， 研究表明其具有抗凋亡作用 。 本研究采 用氧化苦参碱预处理， 并与经典缺血预适应模型 ［3 ］
肌保护作用。 1 材料与方法 1． 1 试验动物及试剂 2 个月龄左右 ） ， 雄性 SD 大鼠 60 只（ SPF 级， 由宁夏医科大学实验动物中 体质量（ 280 ± 10 ） g， 心提供。氧化苦参碱 （ 纯度 99. 8% ， 宁夏紫荆花 制药有限公司， 批号 20091028 ） 。 白屈菜红碱购 于美国 sigma 公司。乳酸脱氢酶 （ LDH ） 检测试剂 盒、 肌酸激酶同工酶 （ CK － MB ） 检测试剂盒购于 南京建 成 生 物 工 程 研 究 所。 超 氧 化 物 歧 化 酶 （ SOD） 检测试剂盒、 心肌丙二醛 （ MDA ） 检测试剂 TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒、 盒、 蛋白提取 PKC 抽提液、 试剂盒、 蛋白含量检测试剂盒、 二抗 均购于南京凯基生物科技发展有限公司 。 PepTag 非放射性蛋白激酶检测系统购于美国 promega 公司。PKCε 抗体购于美国 proteintech 公司。 1． 2 仪器 四道生物机能实验系统 （ BL － 420E 型， 成都 盟泰 科 技 有 限 公 司 ） ； 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机
－1 kg － 1 ， 频率 70 次·min ） 。小心分离一侧颈总动 脉， 以预充肝素后的动脉套管经颈总动脉插入左 －1 ［5 ］ －1
心室结扎固定， 另一端连接压力换能器监测左心 。 室压 心电活动稳定后开胸， 切开心包。 为避免 实验动物心肌缺血面积过大导致死亡， 冠脉阻断 6 － 0 丝线包绕左冠前 点选择在发出圆锥支之后， 降支（ LAD） 后套入内径约 2mm 的橡胶管， 收紧橡 胶管以动脉夹固定即可阻断左冠脉前降支 （ 观察 到左室前壁紫绀充血， 心率减慢， 一过性血压下 降， 心电 S － T 段明显抬高， 其中一项即可确认阻 断成功） 。 以盐水纱布覆盖颈部切口。30min 后 松开动脉夹， 开放左冠前降支， 可观察到缺血区心 肌慢慢变红色， 紫绀区变小， 再灌注 2h。 缺血预 适应模型建立： 麻醉固定、 气管插管、 颈动脉插管、 监护操作同上。 开胸后在左冠状动脉前降支中、 上 1 /3 交接处结扎冠状动脉 5min， 再开放 5min， 如此结扎开放 3 个循环， 完成后结扎冠脉 30min， 再灌注 2h。 假手术组只在左冠脉前降支下方穿 线， 不结扎， 余操作同上。 1． 3． 2 心功能及血流动力学参数的测定 观察 各组动物心电图及心率， 稳定后记录心率 （ HＲ ） 、 左心室收缩压 （ LVSP ） 、 左室压力最大上升 / 下降
机选取 6 只用冰盐水冲洗、 吸干， 以生理盐水为介 －1 质， 用匀浆器 制 成 100g · L 心 肌 组 织 匀 浆， 以 3000r·min － 1 离心 10min 后取上清液分装 － 20℃ MDA。 各项指标均按试剂盒方 冻存， 待测 SOD、 法测定及计算。 1． 3． 5 组织病理学观察 切取心尖组织， 置于 10% 中性甲醛固定 24h， 冲洗、 脱水、 透明、 浸蜡和 60℃ 烘 烤 4h， 包埋。 以 4 μm 厚 度 连 续 切 片， 置 4℃ 下保存待测。行常规 HE 染色、 TUNEL 染色， 400 倍镜检观察。 HE 染色观察： 光镜下观测各组心肌细胞的 ［6 ］ 组织结构及细胞形态， 参照文献 。 心肌细胞凋亡检测： 用 TUNEL 技术检测心肌 细胞凋亡， 正常心肌细胞核呈蓝色， 凋亡细胞呈深 浅不一的棕黑色 （ 阳性 ） 。 每张切片数 5 个以上 的高倍视野（ × 400 ） ， 记 不少于 200 个心肌细胞， 数凋亡细胞数， 以凋亡细胞占所数细胞的百分比 AI） 。 作为心肌细胞凋亡指数（ apoptotic index， 1． 3． 6 心肌组织 PKC 活性及 PKCε 表达的检测 检测原理 分离 PKC 蛋白（ 磷酸化蛋白及非磷酸
S 组、 I / Ｒ 组、 CHE 组和 IP 组给予等量的生理盐 水。术前 1h OC 组和 CHE 组尾静脉注射白屈菜 S 组、 I / Ｒ 组、 OMT 组和 IP 组给 红碱 2mg · kg ， 予注射等量的生理盐水。 心肌缺血再灌注模型的建立按照文献 所 －1 述方法， 用戊巴比妥钠腹腔注射 （ 30mg · kg ） 麻 醉大鼠， 固定并连接多导联心电监护仪。 自尾静 脉输注生理盐水 10mL · （ kg · h ） 。 行颈部正 16 号动脉针套管行气管插管， 中切口， 分离气管， 接动物呼吸机辅助呼吸 （ 控制潮气量 8 ～ 10mL ·
异有统计学意义。 2 结果 2． 1 氧化苦参碱对缺血再灌注大鼠血流动力学 的影响 （ 表 1 ） I / Ｒ 组心率、 与 S 组相比， 左心室功能和血压 均降低（ P 均 ＜ 0． 05 ） ， 说明缺血再灌注模型制作 OMT 组心率加快、 成功。与 I / Ｒ 组相比， 左心室 OC 组、 CHE 组、 IP 功能和血压增高 （ P ＜ 0． 05 ） ，
PKC 阻断剂白屈菜红碱处 苦参碱预处理组（ OMT 组） 、 氧化苦参碱与 PKC 阻断剂白屈菜红碱联合组 （ OC 组） 、 理组（ CHE 组） 和经典缺血预适应组 （ IP 组） 。记录心率（ HＲ） 、 血压、 左心室功能等血流动力学参数 。 再灌注 120min 后， 留取动脉血及心脏组织 ， 分别检测血清中乳酸脱氢酶 （ LDH ） 、 肌酸激酶同工酶 （ CK － MB ） ， 心肌组 织中超氧化物歧化酶 （ SOD） 活性、 心肌丙二醛 （ MDA） 含量等。HE 染色观察心肌组织病理学变化 ； TUNEL 法 检测心肌细胞凋亡情况 。PepTag 非放射性蛋白激酶检测系统检测蛋白激酶 C（ PKC） 活性。免疫印迹法检测 心肌细胞 PKC 的表达。结果 I / Ｒ 组心电图有明显的 ST 段改变。OMT 组 HＲ、 左心室收缩压（ LVSP） 、 左室压 OMT 组与 IP 组 HＲ、 LVSP 无显著差异 力最大上升 / 下降速率（ + LVdp / dtmax / － LVdp / dtmin） 等均高于 I / Ｒ 组， （ P ＞ 0． 05） 。再灌注 120min 后， OMT 组 LDH、 CK － MB 和 MDA 含量显著低于 I / Ｒ 组（ P ＜ 0. 05 ） ， SOD 含量显著 高于 I / Ｒ 组（ P ＜ 0． 05） 。OMT 组 LDH 及 CK － MB 含量低于 CHE 组 （ P ＜ 0． 05 ） 。I / Ｒ 组心肌细胞肿胀， 肌纤维 OMT 组心肌纤维化程度改善， OC 组和 CHE 组 排列松散紊乱， 出现炎细胞浸润及心肌纤维化。和 I / Ｒ 组相比， 未见改善。OMT 组凋亡指数 AI 低于 I / Ｒ 组（ P ＜ 0． 05） ， 与 IP 组差异无统计学意义（ P ＞ 0． 05） 。与 I / Ｒ 组相比， OMT 组 PKC 活性增强， PKCε 表达量增加（ P ＜ 0． 05） 。结论 氧化苦参碱预处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤有 保护作用， 其机制可能为氧化苦参碱通过激活 PKC 启动抗氧自由基、 抗细胞凋亡等内源性保护机制有关。 关键词： 氧化苦参碱； 缺血再灌注损伤； 缺血预处理； 心肌细胞凋亡； 超氧化物歧化酶 中图分类号： Ｒ282 文献标识码： A DOI： 10． 16050 / j． cnki． issn1674 － 6309． 2015． 06． 011
6期
周隆书， 等 . 氧化苦参碱预处理对大鼠缺血再灌注损伤心肌保护作用及其机制研究
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（ H1850Ｒ 型， 长沙湘仪离心 机 仪 器 有 限 公 司 ） ； BIO － ＲAD 酶标仪 （ 美国伯乐公司 ） 。 尼康荧光 显微镜（ Eclipse 80i 型， 日本尼康公司 ） 。 电泳仪 （ 北京六一） 。 1． 3 1． 3． 1 方法 实验分组及模型建立 将入选大鼠随机 分为假手术组（ S 组） 、 缺血再灌注组 （ I / Ｒ 组 ） 、 氧 化苦参碱预处理组（ OMT 组） 、 氧化苦参碱与 PKC 阻断 剂 白 屈 菜 红 碱 （ chelerythrine ） 联 合 组 （ OC PKC 阻断剂白屈菜红碱处理组 （ CHE 组 ） 和 组） 、 经典缺血预处理组（ IP 组） ， 每组 10 只。6 组大鼠
1 1 1 周隆书 ， 赵国龙 ， 李明亮 ， 房 1 磊 ， 王
云
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（ 1． 宁夏医科大学， 银川 750004 ； 摘要： 目的 方法

2． 宁夏医科大学总医院， 银川 750004 ）
观察氧化苦参碱预处理对大鼠缺血再灌注心肌的影响 ， 探究其心肌保护作用及可能的机制 。
60 只 SD 大鼠随机分为假手术组 （ S 组） 、 建立大鼠心肌缺血再灌注模型 ， 缺血再灌注组 （ I / Ｒ 组 ） 、 氧化
化蛋白） ， 利用试剂盒组分将 2 种蛋白组分分离 并区分， 利用琼脂糖凝胶电泳技术显示 2 种不同 的蛋白， 不同蛋白定量采用分析软件加以比较 ， 采 用磷酸化 PKC / 非磷酸化 PKC 灰度值累计光密度 （ IOD） 的比值代表 PKC 活性（ PKC 活化度） 。 PKCε 的表达采用免疫印迹法检测。 1． 4 统计学方法 采用 SPSS 20． 0 统计软件分析结果， 数据以 （x ± s） 表示， 珋 多组间均数的比较采用单因素方差 LSD 法 ） ， P ≤0. 05 为差 分析（ One － way ANOVA，
闭塞 随着冠状动脉手术技术的成熟与推广 ， 血管的再通使心肌得以再灌注， 减轻了心肌缺血， 改善了临床症状。 而再灌注可产生一系列反应， 引起新的心肌损伤—缺血再灌注损伤（ MIＲ ） 。 心 肌细胞凋亡是缺血性心脏病中重要的损伤环 ［1 － 2 ］ 。其机制复杂， 节 主要与微血管损伤、 氧自由 基、 一氧化氮 （ NO ） 、 钙超载、 炎性细胞 及细胞 因子等相关。 氧化苦参碱 （ oxymatrine ） 为抗肿瘤
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宁夏医科大学学报 Journal of Ningxia Medical University