黄河鲶不同组织中RNA提取纯化方法研究
动物组织中总RNA的提取教程文件
(二).鉴定（1.5%琼脂糖电泳鉴定）
操作
1、制胶：1.5%琼脂糖加热溶解冷到
60℃加EB后倒入制胶板中，待凝胶固化
2、加样：15ulRNA提取液+3ul loading buffer
3、电泳80-120v,30分钟
4、紫外灯下观察结果
三.注意事项
防止RNA酶的污染
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干 烤6hr或更长时间。
3.原理
破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗 涤RNA→溶解RNA→鉴定RNA → 保存 RNA
1、 破碎组织:可以用盐酸胍、异硫氰酸 胍、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入 β-ME可以抑制RNA酶活性
2、 分离RNA:一般用酚、氯仿等有机 溶剂，加入少量异戊醇，经过此步， 离心，RNA一般分布于上层，与蛋白 层分开
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。 3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水 冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然 后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理 12hr以上。 5、 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中 手套要勤换,避免在操作中聊天。
关于样本保存
用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
RNA保护剂，如RNAlater是具有抑制 RNase和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织 样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定 样本中RNA的作用。
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
动物组织中总RNA的提取
通过寡聚脱氧胸苷（OligodT）制备 mRNA
提取rna实验步骤
提取rna实验步骤嘿，咱今儿个就来聊聊提取 RNA 的那些事儿！这可真是个精细活儿呢！你得先准备好各种家伙什儿，离心管啦、移液枪啦，就像战士上战场得有称手的兵器一样。
然后呢，把你要研究的样本弄到手，这就好比是找到战斗的目标。
接下来，开始破碎细胞。
你就想象成是给细胞来个“大拆迁”，把它们的外壳啥的都给弄破，让里面的 RNA 能跑出来。
这一步可得小心点儿，别太粗暴了，不然 RNA 也会被你不小心弄伤的哟！然后，加入各种试剂，就像是给 RNA 搭个小窝，让它们能舒舒服服地待着。
这里面的门道可多啦，每种试剂都有它的作用，就像不同的调料能做出不同味道的菜一样。
再之后就是离心啦！这就像是把好的和坏的分离开来，让 RNA 能聚集到一块儿。
离心的时候那机器嗡嗡响，就好像在说：“嘿，我在努力工作呢！”经过一番折腾，你就能看到那一点点珍贵的 RNA 沉淀啦！这就像是在一堆沙子里找到了金子，那叫一个高兴啊！提取 RNA 可不比做饭简单多少啊，每一步都得仔仔细细的，稍有差错可能就前功尽弃啦！你想想，要是好不容易做到最后发现 RNA 没了，那得多郁闷呀！所以呀，做这个实验的时候得打起十二分的精神。
这实验就像是一场冒险，你得小心翼翼地前进，遇到问题就得想办法解决。
就好像你在森林里迷路了，得靠着自己的智慧和勇气找到出路。
而且，这可不是一次就能成功的事儿，有时候得反复尝试好多次呢！咱再说说这 RNA 啊，它可重要啦！它就像是生命的密码，藏着好多好多的秘密。
通过提取它，我们就能解开这些秘密，了解生命的奥秘。
这多神奇呀！总之呢，提取 RNA 实验是个既有趣又有挑战性的事儿。
它需要你的耐心和细心，也需要你对科学的热爱和执着。
如果你能做好这个实验，那你可就是个小科学家啦！加油吧，朋友们，去探索 RNA 的奇妙世界吧！。
rna提取一般步骤总结
RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：| 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。
第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。
实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。
4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA应该尽量低温。
为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。
从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。
另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。
RNA提取
植物中如何提取RNA实验原理RNA的提取：破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。
RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。
在提取RNA实验中，要尽量抑制RNa se的活性。
DEPC（焦磷酸二乙酯）是很强的RNase抑制剂，可以使RNase的活性丧失。
实验中使用的枪头、EP管、溶液都要利用0.1的DEPC处理，Tris不可以用DEPC处理。
耐高温的玻璃器皿等要在250℃烘烤4小时以上。
内源的RNase一般利用蛋白质变性剂除去。
如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。
无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀RNA或DNA，前两者利于沉淀大片段的核酸。
注意：DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物！通常消毒的工作已由你购买试剂的公司完成，你只需买来用就好！关键：1、构建无RNA酶的操作环境2、取样取样品时，要用研钵。
加入液氮，迅速研磨。
由于液氮温度很低，用液氮来冷冻组织可以快速地达到低温，防止组织被破坏。
此外，液氮可使组织液结冰，利于充分研磨。
液氮干后马上再加入少量液氮，再研磨，反复3次。
无RNase条件的建立：1、用70酒精棉球清理试验台离心机等工作范围内。
实验中所用工具需紫外光消毒。
实验所需的枪头、EP管、研磨棒都需做消毒处理2、带一次性口罩，手套，少说话，因为唾液中也含酶。
（经常更换手套可避免RNA酶污染）操作步骤1、取已称重的植物嫩叶，液氮研磨，用1.5ml tube分装样品；2.每管加入0.5ml Trizol 液（裂解液），迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10。
3.室温下静置5～10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离。
4.加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒（或用小型离心机）室温静置5分钟。
5. 12000r/min离心10分钟。
6.取上清液（水相）转入新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，12000r/min离心10分钟。
RNA提取的原理与方法
RNA提取的原理与方法RNA提取的原理与方法细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA 提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取流程1.样品处理从各种不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞）,或同一来源样品的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质量的RNA，因细胞结构及所含的成分不同，样品预处理的方式也各有差异。
样品的要求最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻融，因为这会导致提取的RNA降解和提取量下降。
样品预处理方式植物材料-液氮研磨动物材料-匀浆、液氮研磨细菌-溶菌酶破壁酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁2.细胞裂解异硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）这是一种传统的RNA提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。
异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将RNA释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。
该法应用非常广泛，适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料，同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。
该法主要应用在动物组织和培养细胞的RNA提取中。
胍盐/β-巯基乙醇法适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。
在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制RNaseA的活性，保护RNA不被降解。
我公司的“GREEN”系列总RNA 提取试剂盒是基于这种方法开发的产品，分别适用于各类不同的材料。
此系列产品的具体实验步骤和适用范围在实验技术手册中有详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。
其它方法有些植物材料多糖多酚含量较高，如植物果实，番茄的叶子等，有些植物木质化程度较高，如根茎等组织。
RNA的提取方法
RNA 的提取( TRIzol 法)TRIzol 试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA 。
TRIzol 试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍 / 酚法、酚 /SDS 法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点就是可同时分离一个样品的 RNA/DNA/ 蛋白质。
TRIzol 使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有 RNase 抑制剂可保持RNA 的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA 在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA ，用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
TRIzol 试剂可用于小量样品（ 50-100mg 组织）也适用于大量样品（≥1g 组织）。
可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一个小时内即可完成。
分离的总RNA 无蛋白质和 DNA 污染，可用于 Northern Blot ， dot blot ，ployA 筛选，体外翻译， RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR 时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase 的DNaseⅠ处理RNA 样品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA 可用作标准，比较不同样品RNA 的得率，也可用于 PCR 和酶切。
蛋白质可用于 Western Blotting。
规格： 100mL 黄色透明液体，储存条件：2-8℃避光保存 12 个月，注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。
如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗，乙醇会加重灼伤程度。
1、预防 RNase 污染注意事项（1）经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源。
（2）使用灭过菌的 RNA 专用塑料制品避免交叉污染。
（3）RNA 在TRIzol 试剂中不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 小时，塑料制品可在 0.5M NaOH 中浸泡 10min，然后用水彻底清洗，高温灭菌。
鱼组织血液样本采集及RNA的提取
≥Ｑ鳗墨垡墨垫墨兰！！塑±望查整；！塑·ＭＲＰｌｍＲＮＡ或者是ＭＲＰｌ蛋白过度表达ｍ。
血液系统肿瘤中．ＭＲＰｌ在慢性淋巴细胞性白血病中表达水平较高．实体瘤中．ＭＲＰｌ在小细胞肺癌样本中可以呈８０％高表达水平，而在非小细胞肺癌中１００％表达．其中有３０％样本为高表达水平．由于ＭＲＰｌ甚至可广泛存在于正常组织中１４１．因而此类结果并不难以理解。
在其他肿瘤中．关于ＭＲＰｌ表达水平知之较少．有研究表明在神经母细胞瘤中ＭＲＰｌ表达水平升高８，和Ｎ２ｍｙｅ癌基因扩增和过度表达有联系，而后者则预示着疾病为富有进展性和对化疔抗拒的表型。
本研究对２９例未经任何药物化疗的食管癌组织及其正常食管黏膜标本中ＡＢＣＣｌ的表达进行了检测，结果表明．食管癌组织中ＡＢＣＣｌ的表达水平高于其相应的癌旁正常组织（Ｐ＜０．００１）．这可熊是食管癌对化疗不敏感的原因之一。
在癌组织中，ＡＢＣＣｌ的表达水平与肿瘤的浸润程度和分化程度有关。
在淋巴结转移方面．虽然本组淋巴结转移病例中ＡＢＣＣｌ表达水平高于无转移者．但无统计学差异。
对食管癌标本进行ＡＢＣＣｌ检测，有助于进一步探讨食管癌耐药的分子机制，有助于临床医师较为客观地了解患者的耐药情况，选择合理的化疗方案，并应积极开展逆转肿瘤ＭＤＲ的研究．力争提高化疗效果。
参考文献：【１１ＢｕｓｈＪＡ，ＬｉＧＩ．ｃａｌｌｃ盱ｅｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｅｅ：ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎＰ５３ａｎｄＭｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｌｓｔａｎｃｅ［Ｊ］ＩａｔＪＣａｎｃｅｒ，２００２，９８（３）：３２３【２】２ＬｅｅＤＷ，ＤｅｅｌｅｙＲＧ，ＣｏｌｅＳＰＣＩ．Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｍｔｄｔｉｄｒｕｇｌｅｓｉｓ—ｔａｎｃｅ２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＭＲＰ明ＥｕｒＪＣａｎｃｅｒ，１９９６，３２Ａ（６）：９４５．【３】ＭｅｋｅｒｍａＳＬ，ＰａｕｄａＲＡ．Ｍｕｈｉｄｍｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｌｅｕｋａｅｍｉ郇ＪＢＪＩｌａｅｔｎａｔｏｌ，１９９７，９６（４）：６５９【４ＪＧｃｔｔｅｓｍｍａＭＭ，１３ｔｏＦ，ＢａｔｅｓＳＥｌ．Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｃａｎｃｅｒ：ｒｏｌｅｏｆＡＴＰ２ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔｔ８叨ＮａｔＣａｎｃｅｒＲｅｖ，２００２，２０）：４９．［５】５ＢｏｒｄｏｗＳＢ，ＨａｂｅｒＭ，ｉａｄ止ｇｌｉｏＪ．ｅｔｄ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｔｈａｔｇｒｅｓｉｓｔａｎｅｅ２ａｓｓｏｅｉａｔｅｄｐｒｏｔｏｎ（ＭＲｒ９ｇｅｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＯＶｅｒ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ山ｅＮ２ｍｙｃｏｎｃｏｇｅｎｅｉｎｃｈｉｌｄｈｏｏｄｎｅｕｒｏｈｌａｓ—ｔｏｍａ［ｊ］ＣｍａｅｅｒＲｅｓ，１９９４，５４（１９）：５０３６收稿日期：２００７—０５—２４鱼组织血液样本采集及ＲＮＡ的提取陈传．魏泉德．邵筱（广东医学院寄生虫学教研室．广东湛江５２４０２３）【摘要】目的：探讨从鱼组织、血液样本的采集及提取ＲＮＡ的方法和其他方法的比较。
RNA的分离纯化和检测
第二节 RNA 的分离、检测和纯化在细胞中除了DNA外还有RNA,即rRNA、tRNA和mRNA。
对于基因操作来说，涉及到的RNA主要是mRNA，而mRNA在细胞中的含量又是最少的。
一个典型哺乳动物细胞约含10-5mg RNA ，其中 80-85% 为rRNA（28S,18S 和 5S 三种rRNA），其余15～20% 主要由各种类型的低分子量 RNA 组成（如 tRNA ，核内小分子 RNA 等）。
mRNA 为总RNA的 1～5% 。
同时由于 mRNA 是单链的，容易受到核酸酶的攻击，导致在 RNA 的操作过程中易于遭遇降解的厄运。
因此，对RNA 的操作要求比 DNA 的操作更严格，操作时必须设置专门的处理方法和程序。
一、注意事项 ------ 控制潜在的 RNA 酶的活性1．用具和溶液的去 RNA 酶处理用 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无 RNA 酶污染的用具。
对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用 3%H 2O2 和 0.1% DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。
2．RNA 酶抑制剂的使用为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘 RNase 抑制剂。
除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂）。
二、 RNA 的抽提和纯化1．酚 - 异硫氢酸胍抽提法TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总 RNA 的专用试剂，由 Gibco 公司根据酚 - 异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成。
对任何生物材料的 RNA 提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持 RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心，水相和有机相分离；收集含 RNA 的水相；通过异丙醇沉淀，可获得 RNA 样品。
提取rna的步骤及原理
提取rna的步骤及原理RNA提取是分子生物学实验中的一项重要步骤，它是从生物样本中分离出RNA分子的过程。
RNA提取的原理是利用化学方法破坏细胞膜和核膜，使得细胞内的RNA分子释放出来，并且通过特定的提取试剂将RNA分子纯化出来。
下面将介绍RNA提取的步骤及原理。
首先，准备样本。
样本可以是细胞、组织或者血液等生物材料，需要将样本收集到离心管中，并且在样本收集后尽快进行RNA提取，以保证RNA的完整性和稳定性。
其次，细胞破裂。
细胞破裂是RNA提取的关键步骤之一，可以通过机械破碎或者化学方法来实现。
机械破碎是利用高速离心或者超声波等物理手段破坏细胞膜和核膜，释放细胞内的RNA分子。
化学方法则是利用洗涤缓冲液或者酶来破坏细胞膜和核膜，使得RNA分子得以释放。
接下来，RNA纯化。
RNA纯化是为了去除样本中的DNA、蛋白质和其他杂质，使得提取得到的RNA分子纯度较高。
RNA纯化的方法有很多种，常用的方法包括酚氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
其中，酚氯仿法是通过酚和氯仿的密度差异来分离RNA和其他杂质，硅胶柱法则是利用硅胶柱的亲和性吸附RNA分子，而磁珠法则是利用磁珠表面修饰的特定配体与RNA分子结合，然后通过磁场分离RNA。
最后，RNA溶解。
提取得到的RNA通常以水溶液的形式保存，因此需要将RNA溶解在适当的缓冲液中，以便后续的RNA定量和实验操作。
总的来说，RNA提取的步骤包括样本准备、细胞破裂、RNA纯化和RNA溶解。
通过这些步骤，我们可以从生物样本中高效、纯度较高地提取出RNA分子，为后续的RNA分析实验提供可靠的样本基础。
在实际操作中，需要根据样本的特性和实验的要求选择合适的RNA提取试剂盒，并严格按照试剂盒说明书中的操作步骤进行实验。
此外，为了保证提取得到的RNA质量和数量，需要注意实验中的细节操作，如样本保存、试剂配置、离心参数等，以确保实验的准确性和可重复性。
总之，RNA提取是分子生物学实验中的重要步骤，掌握好RNA提取的原理和操作技巧对于后续的实验结果具有重要的影响。
“一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法”获国家发明专利授权
2017年第12期
71
中国水产科学研究院珠江水产研究所首次繁育成功 美丽硬仆骨舌鱼（青龙鱼）
近日， 中国水产科学研究院珠江 水产研究所观赏渔业研究室首次繁 育成功美丽硬仆骨舌鱼 （青龙鱼） ， 此次孵化的一窝青龙鱼仔鱼14尾， 这 是我国大陆在人工驯养环境条件下 第一次成功繁育出青龙鱼。 青龙鱼对 配偶的选择和繁殖的环境要求比较 苛刻， 在原产地以外一直未能实现 人工繁殖， 项目组在我国大陆开展了 青龙鱼人工繁育技术研究， 历经十余 年研究取得了阶段性突破， 为今后形 成系统性的繁育技术体系奠定基础， 也为保护和合理开发品种提供了技 术支持。 美丽硬仆骨舌鱼 （Scleropages formosus） 根据产地分布 区和体色情况主要分为3个自然群体， 即金龙鱼、 红龙鱼和青 龙鱼， 其原产地都集中在赤道附近上下几个纬度之内， 以体 色差异为主， 青龙鱼呈青灰色。 三个群体中的金龙鱼繁育已 于2007年被珠江所攻克， 并已多次重复验证。 另外， 珠江所 已连续多年繁育成功双须骨舌鱼 （银龙鱼） 。 此次青龙鱼的 繁育成功， 标志着珠江所已突破3种龙鱼的繁育技术难关， 这为今后我国龙鱼产业的国产化、 规模化奠定技术基础。
科技 之窗
“一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法” 获国家发明专利授权
日前， 由中国水产科学研究院黄海水产研究所史宝 博士等发明的 “一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法” 获国家发明专利授权， 专利号： ZL 201610202508.9。 本发明提供了一种快速简便， 总 RNA纯度高、 杂质 少、 得率大， 易于操作， 便于掌握的微量鱼类卵母细胞 总RNA提取的方法。 利用化学法和超声波破碎、 延长离 心时间等方法相结合， 有效去除微量卵母细胞中核糖体 和蛋白质等成分， 获得卵母细胞中含有的总RNA， 保证 RNA完整性， 并提高所获的RNA纯度与质量。 这一新型的鱼类卵母细胞总RNA的提取方法， 可以 获得纯度高、 完整性好的卵母细胞总RNA， 为采用实时 荧光定量RT-PCR技术或基于微量RNA的高通量测序技 术分析卵母细胞发育成熟的分子机理提供技术支撑。
兰州鲇生长性状相关基因的分离、序列特征及组织特异性表达分析
兰州鲇生长性状相关基因的分离、序列特征及组织特异性表达分析兰州鲇生长性状相关基因的分离、序列特征及组织特异性表达分析摘要：鲇鱼是重要的经济鱼类之一，而其生长性状的调控对养殖业的发展具有重要意义。
本研究旨在分离兰州鲇（Lanzhou nain）生长性状相关基因，并进行序列特征及组织特异性表达分析。
通过RNA提取和RT-PCR技术，获得了多个候选基因的全长序列，并进行了进一步的功能注释和蛋白结构预测。
同时，通过实时荧光定量PCR技术，研究了这些基因在不同组织中的表达模式，以期深入了解兰州鲇生长性状调控的基因机制。
关键词：兰州鲇；生长性状相关基因；序列特征；组织特异性表达1 引言鲇鱼是一种重要的经济鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者的喜爱。
然而，兰州鲇的生长速度相对较慢，限制了其养殖业的发展。
生长性状是由多个基因共同调控的，因此研究兰州鲇生长性状相关基因，对于改良其生长性状具有重要意义。
2 材料与方法2.1 取样与RNA提取从兰州鲇身体不同部位（肝、脾、鳔、肌肉、皮肤、脊髓）分离总RNA，采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，检测RNA的纯度和浓度。
2.2 基因的分离与全长序列获取设计引物，采用RT-PCR技术进行基因分离，并通过克隆和测序得到基因的全长序列。
2.3 序列特征分析利用生物信息学软件对基因全长序列进行物理化学性质、保守性和功能域分析。
3 结果与讨论3.1 基因的分离与全长序列获取本研究成功分离得到了与兰州鲇生长相关的多个候选基因，并通过克隆和测序获得了这些基因的全长序列。
3.2 序列特征分析对这些基因的全长序列进行了一系列的特征分析。
结果显示，这些基因的物理化学性质与已报道的生长相关基因相似，例如，具有较高的等电点和疏水性。
此外，多个保守性位点和功能域也被发现，这进一步支持了这些基因的功能与生长性状调控有关。
3.3 组织特异性表达分析通过实时荧光定量PCR技术，研究了这些基因在兰州鲇不同组织中的表达模式。
广藿香不同组织总 RNA 提取方法的筛选与优化
广藿香不同组织总 RNA 提取方法的筛选与优化陈英;吴友根;杨东梅;张军锋;林尤奋;胡新文【摘要】分别采用Trizol法、改良Trizol法、CTAB法、改良CTAB法和异硫氰酸胍－SDS法等5种方法提取广藿香叶、茎、根及愈伤组织的总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外光谱检测其提取效果。
结果表明，Trizol法适用于广藿香叶片总RNA的提取，改良CTAB法适用于广藿香茎和愈伤组织总RNA的提取，而广藿香根总RNA的提取宜用改良Trizol法。
RT－PCR检测结果表明，广藿香各组织的总RNA可直接用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学试验。
【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】3页(P53-55)【关键词】广藿香;总RNA;提取方法;Trizol法;CTAB法;异硫氰酸胍-SDS法【作者】陈英;吴友根;杨东梅;张军锋;林尤奋;胡新文【作者单位】热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228;热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228;热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228;热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228;热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228;热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/海南大学园艺园林学院，海南海口570228【正文语种】中文【中图分类】Q522广藿香[Pogostemon cablin (Blanco) Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，原产于东南亚地区如马来西亚、菲律宾、印度尼西亚等国，在我国引种可追溯到梁代或以前[1]。
我国主要栽培地为海南和广东2省，广西、福建及台湾等地也有少量栽培。
植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)
二、仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1.材料：植物任何部分的新鲜组织 2.试剂： ① 水饱和酚(pH4.9)； ② 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液； ③ 3mol/L NaAc(pH 5.2)； ④ RNA提取缓冲液：内含0.2mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.4mol/L LiCl、25mmol/L EDTA和1%SDS； ⑤ 2mol/L LiCl； ⑥ 75％乙醇；
7．重复步骤6，直至无白色界面物质。 8．将水相转至对应的灭菌离心管中，加入等体积氯仿振荡混 匀，以除去痕 量的苯酚。 9．室温下、12000g离心5min。 10．将上层水相转移至对应的灭菌离心管中，加入1/10体积的 NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃ 放置30min。 11．4℃、12000g离心20min。 12．弃去上清夜，向沉淀加入0.3ml LiCl(2mol/L)，并振荡溶 解，冰上静置 10－30min。4℃、12000g离心20min。 13．弃去上清液，加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O，无RNase)， 振荡使沉淀溶解。 14．加入1/10体积的NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙 醇，混匀，-70℃放置30min。 15．4℃、12000g离心20min。
实验三 植物RNA的分离纯化(Cl沉淀法) 植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法)
一、实验原理
总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA。与DNA一 样，RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。RNA分子主 要存在于细胞质中，约占75%，另有10%存在于细胞核内，15% 在细胞器中。RNA以rRNA的数量最多(80-85%)，tRNA 及核内小 分子RNA占10%-15%，而mRNA 分子只占1%-5%。mRNA 分子大小 不一，序列各异。 RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性，同 时并使DNA变性，再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖 等物质，在RNA沉淀剂的作用下，针对性分离出RNA。 总RNA提取原则：① 保持核酸结构的完整性；② 排除其 它分子的污染。
观赏海棠不同组织中RNA的几种提取方法
观赏海棠不同组织中RNA的几种提取方法刘艳娜;李育奇;宋婷婷;于凤鸣【摘要】CTAB method, Guanidine thiocyanate method and Tris— borate method were employed to isolate total RNA from different organizationsof Malus crabapple. The quality and quantity of RNA were compared among the three methods. The results showed that RNA extracted by Guanidine Thiocyanate method had good quality and high purity, and the CTAB method had low expense, while Tris-borate method was not fit for RNA extraction from the fruits with polyphenols and polysaccharides organizations.%以观赏海棠不同组织为试材,用常用的CTAB法、异硫氰酸胍法及Tris-硼酸法,比较其提取RNA的质量和纯度.结果表明:CTAB法提取RNA成本低、RNA质量较高;异硫氰酸胍法提取RNA的质量好、纯度高、提取效率高;而Tris-硼酸法则较不适合于果实类多酚多糖组织的RNA提取.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2012(027)004【总页数】3页(P7-9)【关键词】RNA;提取;CTAB;异硫氰酸胍;Tris-硼酸法【作者】刘艳娜;李育奇;宋婷婷;于凤鸣【作者单位】河北科技师范学院,河北066004;北京农学院,北京102206;北京农学院,北京102206;北京农学院,北京102206;河北科技师范学院,河北066004【正文语种】中文【中图分类】S661.4观赏海棠（Malus crabapples）属于蔷薇科苹果属植物，其果色、叶色、花色色彩多样，树形紧凑极具观赏价值，并且部分品种具有抗逆性强。
鱼类RNA提取步骤
鱼类RNA提取步骤Gene fishingTotal RNA提取→RT→18S验证→目的片段扩增→胶回收→连接→转化→涂板→挑取白色菌落扩大培养→菌液鉴定→测序Total RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、75%酒精（用DEPC水稀释）、DEPC水1．组织匀浆：0.05-0.1g组织加入液氮中研成粉末，加入1ml Trizol中，注射器抽提至组织溶解，4℃裂解过夜或起码1h；2．离心机4℃预冷，Trizol室温静置5min；3．加入200ul氯仿，剧烈振荡15sec（涡旋混匀），室温静置15min；4．12000rpm，4℃，15min，转移400ul上清液至新的离心管（注意不要吸到中间蛋白层）；5．加入500ul异丙醇，剧烈振荡，室温静置5-10min，12000rpm，4℃，10min；6．弃上清，加入1ml 75%酒精，涡旋混匀至RNA块漂浮起来，12000rpm，4℃，5min；7．弃上清，12000rpm，4℃，2min；8．用小枪头吸去多余酒精，室温干燥1-2min，开盖平放；9．加入20-50ul DEPC水，4℃溶解1-2h，室温10-20min；RNA质量检测：OD值的测定：OD260/280应在1.9-2.0R＜1.8：样品中含有较多的蛋白质等有机物；R＞2.0：RNA降解，大于2.2说明已被水解为单核苷酸电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，新鲜TAE Buffer 1ug RNARNA亮度28S＞18S＞5S 性腺则5S较亮真核生物有4种rRNA，它们分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1900和4700个核苷酸。
rRNA是单链，它包含不等量的A与U、G与C，但是有广泛的双链区域。
在双链区，碱基因氢键相连，表现为发夹式螺旋。
RNA的提取纯化_百替生物
RNA的提取纯化ＲＮＡ酶活性的控制为了获得高质量的真核细胞mＲＮＡ，必须使用ＲＮＡ酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的ＲＮＡ酶的活性。
同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量ＲＮＡ酶也很重要。
下面列举避免ＲＮＡ酶法染问题的一些注意事项。
大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。
实验程序ＲＮＡ酶的抑制剂破碎细胞和灭活ＲＮＡ酶同步进行的方法（一）实验程序如不谨慎操作，外源性ＲＮＡ酶可以通过下述途径污染ＲＮＡ制品：（１）玻璃制品、塑料制品和电泳槽灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无ＲＮＡ酶，可以不经预处理直接用于制备和贮存ＲＮＡ。
实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有ＲＮＡ酶法染，使用前必须于180 ℃干烤８小时或更长时间（玻璃器皿）或用氯仿冲洗（塑料制品）。
另一种方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）的水溶液浸泡用于制备ＲＮＡ的烧杯，试管和其他用品。
ＤＥＰＣ是ＲＮＡ酶的强烈抑制剂，但其作用并不是绝对的（Ｆedorcsak和Ehrenberg,1966）。
灌满ＤＥＰＣ的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟（Ｋumar和Ｌindberg,1972)。
在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高压蒸氯灭菌15分钟。
上述处理可以除去器甲上痕量的ＤＥＰＣ，以防ＤＥＰＣ通过羧甲基化作用对ＲＮＡ的嘌呤碱基进行修饰。
羧甲基化的ＲＮＡ在无细胞体系中翻译效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤碱基均被修饰，否则其形成ＤＮＡ：ＲＮＡ或ＲＮＡ：ＲＮＡ杂交休的能力并不明显降低。
用于ＲＮＡ电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满３％的Ｈ２Ｏ２溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1 ％ＤＥＰＣ（见下文）处理过的水彻底冲洗电泳槽。
最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为ＲＮＡ实验专用。
组织RNA提取
哺乳动物组织样品RNA的抽提哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。
一、实验材料：Trizol试剂（Invitrogen公司）研钵，镊子，小药勺，铝箔都高温（180℃，3-4h）灭菌即可；二、具体过程：1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。
组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。
可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。
2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。
从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。
一次研磨的组织块重量不要超过300mg。
3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，用药勺将粉末刮到1.5ml EP管（无RNA酶，空管先称重）中，然后将EP管+组织粉末一起称重，计算出加入管子中的组织重量，然后确定加入Trizol的量（50-100mg组织加入1ml Trizol），若 Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。
由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。
5、后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。
说明：1、研磨，匀浆过程中使用过的器具洗刷晾干后包上铝箔后，180℃烘烤4小时以备下次使用。
2、此方法看上去过程虽然比较繁琐，但得到的RNA质量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃镜标本平均能提出约10 ug 总RNA，足够做一张人22K全基因组芯片了。
得到的RNA的电泳检测图片如图7。
3、另外在我们的工作中，接触到一些用户在取了组织后，马上冻到-70℃冰箱来保存，然后提取RNA做反转录，这样的样品中RNA往往有较大的降解，用来做一些基因的RT-PCR还可以，但若做芯片工作就不行了。
RNA提取步骤范文
RNA提取步骤范文RNA（核糖核酸）是一种在细胞中起着重要功能的分子，它具有基因表达和蛋白质合成的关键作用。
因此，从样本中提取RNA是进行进一步分析和研究的基本步骤之一、下面是RNA提取的一般步骤，包括样本收集、细胞破碎、RNA纯化和RNA质量评估等过程。
1. 样本选择和收集：首先，需要确定要提取RNA的样本类型，例如动物组织、细胞培养物或植物物质等。
然后，收集样本，并迅速将其置于适当的保存液中，如RNAlater。
2.细胞破碎：在提取RNA之前，细胞或组织必须被完全破碎以释放RNA。
有几种方法可以实现这一点，包括机械破碎（如超声波处理或研磨）和酶解。
对于动物组织，还可以使用组织破碎机或液氮研磨。
3.RNA纯化：细胞破碎后，需要将RNA与其他细胞组分（如DNA和蛋白质）分离。
RNA纯化的常见方法包括酚-氯仿萃取和商业RNA提取试剂盒两种。
酚-氯仿萃取是传统的RNA纯化方法，它通过使用酚和氯仿混合溶液来分离RNA。
该方法包括以下步骤：a.酚和氯仿混合液特异性地捕获RNA并与其他细胞组分分离。
b.通过离心使RNA从酚-氯仿混合液中分离出来。
c.通过酒精沉淀将RNA沉淀下来。
d.通过洗涤去除杂质。
e.最后，通过溶解RNA的转运RNA酶去除DNA的污染。
商业RNA提取试剂盒可以通过使用特定柱子和试剂来纯化RNA，这些柱子和试剂可以选择性地结合RNA并去除DNA和蛋白质。
这些试剂盒通常具有简单的操作流程，并提供高效、稳定的RNA提取。
4.RNA质量评估：提取到的RNA需要进行质量评估，以确定提取过程中是否存在任何污染或降解。
常见的评估方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和分光光度测量。
通过这些方法，可以确定RNA的完整性和纯度。
5.可选的步骤：根据研究的特点，可以对提取到的RNA进行进一步处理。
例如，可以通过反转录转录，将mRNA转录成cDNA用于后续的PCR扩增或测序。
总结起来，RNA的提取过程包括样本选择和收集、细胞破碎、RNA纯化和RNA质量评估等步骤。
有关核酸提取与鉴定的最基本实验
2021/6/20
8
RNA抽提注意事项
1、器皿处理，塑料用DEPC浸泡，玻璃用高温处理。
2、样本要求：新鲜。
3、操作温度：尽可能在低温下操作，如液氮里或冰浴 上。
4、操作过程防污染（口罩手套、环境干净）。
5、每一步操作注意点：匀浆（完全）
萃取（吸取上层的60%-70%）
沉淀、洗涤按操作规程
2021/6/20
12
2）加200µL新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀
释）、1%SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应
确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将
离心管放置于冰上。
3）加150µL用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
干燥（不能用真空干燥，要自然干燥）
6、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA 2021在/6/2700%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 9
细菌质粒DNA的提取与纯化
2021/6/20
10
细菌的收获
收获
1）将2ml含抗生素的LB加入到容量为15ml
并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一
3、 取上层水相于新EP管，按每1ml Trizol液 加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置 10分钟，12000g离心10分钟；
2021/6/20
5
4、 弃去上清液，按每1ml Trizol液加入至少 1ml的比例加入75%乙醇，混匀，4℃下7500g 离心5分钟；
5、 重复第4步；
有关核酸提取与鉴定的最基本实验
2021/6/20
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第36卷 第2期Vol 136No 12淡 水 渔 业Freshwater Fisheries2006年3月M ar 12006 收稿日期:2005-12-27资助项目:宁夏回族自治区8613重大农业科技攻关项目(2002-Z01-04)资助第一作者简介:吴旭东(1967- ),宁夏银川人,中国农业大学博士,主要从事农药学和水生生物学研究。
通讯作者:侯玉霞。
E -mail:houyuxia@cau 1edu 1cn黄河鲶不同组织中RNA 提取纯化方法研究吴旭东,侯玉霞,张文吉(中国农业大学理学院,北京 100094)摘 要:从组织提取RNA 的完整性对于分子生物学研究是至关重要的。
RNA 提取方法有多种。
采取异硫氰酸胍法从黄河鲶肌肉、血液、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢中提取出完整RNA,结果表明,通过该方法所提取RNA 质量高,效果好,可以用于进一步的分子生物学研究。
关键词:黄河鲶;RNA 提取;异硫氰酸胍法中图分类号:S917;Q9591406 文献标识码:A 文章编号:1000-6907-(2006)02-0024-03The M ethod of Extracti n g and Pur i fy i n g RNA from D i fferen t T issuesof the Y ellow R i ver Ca tf ishWU Xu 2dong,HOU Yu 2xia,Z HANG W en 2ji(College of Science,China A gricultural U niversity,B eijing 100094)Abstract:The integrality of RNA extracted and purified fr om tissues is essential f or molecular bi ol ogy .Some useful ex 2tracting and purifying methods had been discovered .Guanidine Thi ocyanate is ideal f or extracting and purifying RNA of the Yell ow R iver catfish .Thr ough this method,RNA of high quality had been obtained fr om muscle,bl ood,kidney,liver,ovary,which can be used for the further molecular bi ol ogy research .Key words:the Yell ow R iver catfish;RNA extracti on;Guanidine Thi ocyanate 黄河鲶RNA 提取是进行黄河鲶分子生物学研究的基本技术之一,是进行基因表达研究的基础。
可以利用RNA 对目的基因的表达进行定量检测,从分子水平精确地了解细胞生命活动的规律。
对于黄河鲶c DNA 文库的构建,Northern 杂交分析以及利用mRNA 差异显示技术筛选感兴趣的相关基因等均需要完整的RNA 。
RNA 提取的最大困难是RNA 容易降解,而RNA 酶(RNase )又无处不在,难于灭活,所以在整个分离RNA 系统中应避免污染RNA 酶。
目前,RNA 提取方法有多种,如异硫氰酸胍/氯化铯法、硫氰酸胍/热酚法、氯化胍法、氯化锂/异硫氰酸胍法[1～3]。
本研究采取异硫氰酸胍法提取黄河鲶肌肉、血液、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢的RNA ,得到了高纯度、完整的RNA 。
1 材料与方法111 材料所用黄河鲶于2004年6月取自宁夏水产研究所养殖场,健康状况良好,体重500g 左右。
采用尼龙袋充氧后快速运回实验室,在玻璃缸短暂养殖。
112 玻璃器皿及塑料制品的处理玻璃器皿、研钵、试剂勺等清洗干净后在200℃烘烤8h 。
塑料制品用011%的DEPC (焦碳酸二乙酯)溶液浸泡过夜,并在121℃高压灭菌30m in 以除去DEPC,100℃烘干备用。
113 试剂①变性液:4mol/L 异硫氰酸胍、26mmol/L柠檬酸钠(pH410)、015%月桂基肌酸钠、01125mol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L EDT A(pH 810);②酚、氯仿、异戊醇25∶24∶1;③异丙醇;④70%乙醇;⑤磷酸盐缓冲溶液(P BS):1115g 磷酸氢二钠,012g磷酸二氢钾,8g氯化钠, 012g氯化钾,pH714;⑥醋酸钠溶液(2mol/L, pH410);⑦DEPC水:双蒸水加入DEPC至终浓度为011%,于37℃放置过夜,121℃灭菌;⑧10×MOPS电泳缓冲液:012mol/L MOPS(pH710), 20mmol/L乙酸钠,10mmol/L EDT A(pH810);⑨10×凝胶加样缓冲液:50%甘油,10mmol/L EDT A(pH810),0125%溴酚蓝,0125%二甲苯青。
以上溶液均用011%DEPC水配置,灭菌处理。
114 方法①取样: A.血液:断尾取血8～10mL,用25mL冷P BS缓冲液洗血样,在4℃条件下300g 离心5m in,取沉淀,重复一次。
在预冷的研钵中研磨。
B.肌肉、全鱼、肾脏、肝脏、卵巢:立即剪取新鲜组织后,迅速把250mg样品放入用液氮预冷的研钵中研磨,不时添加液氮直至研成细粉,倒入液氮成蜂窝状即可。
②将研磨的组织转入经DEPC处理、预冷的聚丙烯带盖离心管中。
离心管内已经分装3mL变性液在冰上预冷5m in。
剧烈振荡15～30s,加入300μL2mol/L醋酸钠溶液(pH410),颠倒离心管4～5次使其充分混匀。
③加入3mL酚、氯仿、异戊醇混合液(25∶24∶1),上下颠倒3～5次,剧烈振荡10s使其充分混匀,冰浴15m in。
使核蛋白复合体彻底裂解。
④10000g离心20m in(4℃),吸取上层水相部分转到新的DEPC处理过的离心管中,吸取过程中要避免吸入下层有机相(有机相中含有基因组DNA)。
⑤在水相加入等体积的异丙醇,-20℃沉淀30m in。
⑥10000g离心10m in(4℃)沉淀RNA。
⑦加入215mL变性液重新溶解RNA沉淀,直到RNA沉淀完全溶解。
⑧加入等体积的异丙醇沉淀RNA,上下颠倒混匀,-20℃沉淀30m in。
⑨10000g离心10m in(4℃),收集RNA沉淀。
⑩用3mL预冷70%乙醇洗涤沉淀,10000g 离心10m in(4℃),吸尽残存的乙醇。
重复三次后,将RNA沉淀在超净工作台上风干20～30m in,风干时间取决于沉淀量的多少,达到近干即可,否则RNA难于溶解;将风干RNA沉淀用合适体积的无RNase水溶解。
用112%甲醛琼脂糖凝胶电泳检测后,RNA样品储存于-80℃。
115 浓度和纯度检测分离的总RNA用经无RNase水稀释后,利用分光光度计测定260nm的吸光值,计算RNA浓度。
在紫外分光光度计上检测230nm、260nm和280n m的吸光值,以计算A260nm/A230nm、A260nm/ A280nm比值检测RNA质量。
2 结果与分析用112%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,以不出现拖尾带为标准,由于RNA中r RNA占90%左右,所以在电泳图谱中看到的是r RNA,包括28S、18S和5S的r RNA。
mRNA呈弥散状分布其间。
图1所示为所提取的总RNA通过112%变性凝胶电泳检测所得的图谱,所提取RNA的完整性好,28S和18S r RNA比率约为2∶1,通过溴化乙锭染色显示出RNA没有降解。
如果RNA样品降解, 28S和18S r RNA比率发生变化,28S r RNA降解为类似18S r RNA,避免RNA降解应该建立无RNase 的环境。
从图1所示我们所提取的RNA没有降解,完整性非常好。
图1 鲶基因组RNA电泳图谱Fig11 Electr ophoresis pattern of geon me RNA图示中11肌肉RNA;21血液RNA;31全鱼RNA;41肾脏RNA;51肝脏RNA;61卵巢RNA11muscle RNA;21bl ood RNA;31whole fish RNA41kidney RNA;51liver RNA;61ovary RNA3 讨论异硫氰酸胍法采用剧烈的蛋白变性剂,能够抑制RNA酶活性,还能有效地解离核蛋白与核酸的复合体,成为获得黄河鲶高纯度RNA比较理想的方法。
成功地提取高质量黄河鲶RNA关键所在:①52第2期吴旭东等:黄河鲶不同组织中RNA提取纯化方法研究去除蛋白质、多糖等杂质。
为了除尽蛋白等杂质,可以增加酚、氯仿、异戊醇混合液的抽提次数,直至除尽蛋白为止。
②防止RNase降解RNA。
RNA 极易被RNase降解,为了获得高质量的RNA,必须避免RNase的污染。
RNase是一类生物活性非常稳定的酶类,耐酸、耐碱、耐热,因此在提取RNA的过程中应创造一个无RNase的环境,尽量减少外源和内源RNase的污染。
外源性RNase主要来源于操作者的手、头发、唾液及各种实验器皿、试剂等,可通过戴一次性手套、戴口罩、穿洁净的工作服防止操作人员的污染。
200℃高温干烤玻璃器皿及用011%DEPC水处理不耐高温的实验用品除去RNase;内源性RNase来自于样品的组织和细胞,可通过强烈的RNase抑制剂如硫氰酸胍来抑制。
另外,肝脏、肾脏等组织中脂肪含量较高,对提取RNA纯度影响较大,实验过程中可以通过多次酚、氯仿、异戊醇混合液和氯仿、异戊醇混合液抽提对其进行纯化。
参考文献:[1]J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京:科学出版社,2002,518～521.[2]王雁云,罗开梅,李永青,等.一种快速的胚胎组织总RNA的提取方法[J].生命科学研究,2001,5(1):88～90. [3]Chirg win J M,Przybyla A E,Macdonald R,et al.Is olati on ofbi ol ogically active ribonucleic acid fr om s ources enriched in ribonu2 cleare[J].B i oche m istry,1979,18:5294～5299.62淡 水 渔 业 2006年。