心肌检测标志物_肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究

重组肌红蛋白的原核表达_纯化及其冻干质控品的制备_任艳娜

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第8期急性心肌梗死（Acute myocardiac infraction，AMI）是严重危害人类健康的常见疾病之一。

近年来，在我国该病的发病率呈明显升高的趋势。

肌红蛋白（Myoglobin，Myo）是AMI 发生时最早升高的心肌损伤标志物之一，在发病2 h 内血清中Myo 的含量开始增加，6-9 h 达到峰值。

1975年，Kagen 等［1］首次提出血清Myo 的测定可用于急性心肌梗塞的诊断，收稿日期： 2013-12-18作者简介：任艳娜，女，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学；E -mail ：yanna052267213@ 通讯作者：唐时幸，男，博士，研究方向：生物医学；E -mail ：tang.shixing@重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备任艳娜才蕾武建伟钱伟张荣华王继华唐时幸（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）摘要：旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成，并连接到pET -28a 表达载体上，转入大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达；目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对冻干质控品的稳定性进行检测；结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD 左右，具有较强的特异性。

蛋白冻干后具有很好的形态，37℃可以稳定保存10 d ；25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。

该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。

关键词：重组肌红蛋白原核表达纯化冻干质控品The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin andPreparation of Its Quality Control SamplesRen Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd ，Guangzhou 510663）Abstract: We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits. The myoglobin gene code was optimized and two -step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of myoglobin was inserted into pET -28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with high specificity, good morphology and stability after freeze -drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative myoglobin testing kits.Key words: Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples检测病人的Myo 水平可以快速确诊并及时治疗，从而降低病死率［2］。

急性心肌梗死诊断的生物标志物研究进展

急性心肌梗死诊断的生物标志物研究进展肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白、和肽素、心型脂肪酸结合蛋白、缺血修饰白蛋白、B型钠尿肽、生长分化因子-15、C反应蛋白、髓过氧化物酶等标志物，对急性心肌梗死（AMI）有一定的诊断价值。

为了明确各种心肌梗死生物标志物对AMI鉴别诊断的意义，笔者对有关研究进展进行综述。

标签：急性心肌梗死；标志物；肌红蛋白；肌酸激酶同工酶随着我国急性心肌梗死（AMI）的患病率和病死率日趋增高，早期生物标志物凭其高度的敏感性及特异性，对AMI的早期诊断、积极治疗日趋重要。

在临床研究和应用发展的同时，除了肌红蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等已应用于临床的标志物外，目前已有越来越多新的标志物，对AMI的诊断具有重要价值。

现就AMI生物标志物的最新研究进展作一综述。

1急性心肌梗死概述急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。

临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。

研究证实在冠状动脉粥样硬化狭窄基础上，由于某些诱因致使冠状动脉粥样斑块破裂，血中的血小板在破裂的斑块表面聚集，形成血栓，引起冠状动脉部分或完全闭塞从而导致心肌缺血坏死是引发AMI的重要机制，而随之而来的心原性休克、心力衰竭、心律失常及心脏破裂等多种并发症是会造成严重不良后果。

2013年世界卫生组织进行流行病学调查发现AMI好发于欧美国家，而且地区之间有很大的差异。

随着社会老龄化，现代生活节奏的加快，饮食习惯的改变以及社会、心理等因素的影响，我国AMI的发病率也呈现逐年升高的趋势，在2010年我国新发AMI患者达到203万例，每年新发至少50万例。

ANI的常见诱因包括过劳、激动、暴饮暴食、寒冷刺激和便秘，还有高血压、糖尿病、血脂异常以及家族史等传统的危险因素。

AMI的病死率较高，严重危害人们的生命健康。

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***************************************************************************************试题说明本套试题共包括1套试卷每题均显示答案和解析军队文职人员招聘_医学检验技术_真题模拟题及答案_第02套(150题)***************************************************************************************军队文职人员招聘_医学检验技术_真题模拟题及答案_第02套1.[单选题]测定HCT的参考方法为A)折射计法B)离心法C)比重法D)血液分析仪法E)放射性核素法答案:E解析:放射性核素法：ICSH曾推荐为参考方法，准确性最高；方法繁琐、特殊，不适用于临床常规检查。

2.[单选题]化脓性病原菌由局部侵入血流，并在血液中生长繁殖是为A)脓毒血症B)毒血症C)菌血症D)败血症E)内毒素血症答案:A解析:3.[单选题]不具荚膜的细菌是A)肺炎链球菌B)炭疽芽胞杆菌C)结核杆菌D)克雷伯菌E)隐球菌答案:C4.[单选题]骨骼肌中含量最多的CK同工酶是A)CK-MMB)CK-MBC)CK-BBD)CK-MiMiE)AK答案:A解析:本题考查CK的同工酶分布，CK-MB主要分布于心肌中；脑、前列腺、肠、肺、膀胱、子宫、胎盘及甲状腺中CK-BB占优势；骨骼肌及心肌中CK-MM占优势。

5.[单选题]最常见的肠外阿米巴病是A)脑脓肿B)肝脓肿C)肺脓肿D)脾脓肿E)皮肤脓肿答案:B解析:肠外阿米巴病主要通过血液传播，肠道静脉血液回流一般首先到达肝脏。

6.[单选题]疥疮实验诊断方法为A)粪便涂片检查B)血液涂片检查C)活组织检查D)消毒针挑破局部皮肤检查E)免疫学方法检查答案:D解析:对疥疮的确诊，最可靠的方法是从局部皮肤中找到虫体，常用消毒针头将局部皮肤挑破，取出虫体在显微镜下鉴定。

肌红蛋白的结构、功能及其模型化合物的构建

肌红蛋白的结构、功能及其模型化合物的构建摘要：肌红蛋白是肌肉中运载氧的蛋白质，由153个氨基酸残基组成，含有血红素，和血红蛋白同源，与氧的结合能力介于血红蛋白和细胞色素氧化酶之间，可帮助肌细胞将氧转运到线粒体。

它是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白，是肌肉内储存氧的蛋白质，它的氧饱和曲线为双曲线型。

在人体中起到十分重要的作用。

关键词：肌红蛋白、蛋白质、功能、模型化合物正文一、肌红蛋白的结构1、肌红蛋白的蛋白质结构肌红蛋白（myoglobin，MYO,Mb）是肌肉中的一种贮氧蛋白。

由153个氨基酸残基组成，含有血红素，和血红蛋白同源，与氧的结合能力介于血红蛋白和细胞色素氧化酶之间，可帮助肌细胞将氧转运到线粒体。

肌红蛋白存在于肌肉中，心肌中含量特别丰富。

抹香鲸肌红蛋白三级结构于1960年由Kendrew 用X线衍射法阐明，这是世界上第一个被描述的蛋白质三级结。

以抹香鲸肌红蛋白为例：肌红蛋白由一条多肽链和一个辅基多肽链组成：由153个氨基酸残基组成，辅基：亚铁血红素辅基，分子量：16 700。

形状：呈紧密球形，多肽链中氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部,亲水侧链多位于分子表面,因此其水溶性较好。

三级结构有8段α-螺旋区，每个α-螺旋区含7～24个氨基酸残基，分别称为A、B、C…G及H肽段。

有1～8个螺旋间区，肽链拐角处为非螺旋区（亦称螺旋间区），包括N端有2个氨基酸残基，C端有5个氨基酸残基的非螺旋区，处在拐点上的氨基酸残基Pro, Ile, Ser, Thr, Asn等。

极性氨基酸分布在分子表面，内部存在一口袋形空穴，血红素居于此空穴中。

血红素是铁卟啉化合物，它由4个吡咯通过4个甲炔基相连成一个大环，Fe2+居于环中。

铁与卟啉环及多肽链氨基酸残基的连接：铁卟啉上的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连。

血红素的Fe2+与4个咯环的氮原子形成配位键，另2个配位键1个与F8组氨酸结合，1个与O2结合，故血红素在此空穴中保持稳定位置。

心肌损伤标志物检验

心肌损伤标志物检验心肌损伤标志物检验是一种常见的临床检查项目，用于判断心脏是否存在损伤和疾病。

这个检验是通过对血液中心肌特异性蛋白质和酶的测量来进行的。

在正常情况下，这些蛋白质和酶都不会存在于血液中，但当心肌受损时，它们会通过血流释放到血液中，从而成为心肌损伤的标志物。

常见的心肌损伤标志物肌红蛋白（Myoglobin）肌红蛋白是在心肌受损后最早能够被检测到的标志物之一。

它是一种蛋白质，广泛存在于骨骼肌和心肌中。

当心肌细胞受损时，肌红蛋白会从心肌细胞中释放，并快速进入到血液中。

因此，肌红蛋白的检测可用于早期监测急性冠脉综合征（ACS）的预后。

肌酸激酶（CK）肌酸激酶（CK）是一种在骨骼肌组织、心肌组织和其他组织中存在的酶类。

当这些组织受损时，CK会被释放到血液中。

因此，CK的检测可以用于检测心肌损伤，包括急性心肌梗死。

肌钙蛋白（cTn）肌钙蛋白(cTn)是一种高度特异性的心肌标志物，由于释放到血液中的cTn不存在于正常血液中，因此被称为心肌特异性标志物。

在心肌细胞受损时，cTnI和cTnT（两种常见形式）从心肌细胞中释放，可用来检测急性心肌梗死、稳定性心绞痛和其他心血管疾病。

心肌损伤标志物检验的操作和结果分析心肌损伤标志物检验主要是通过血样取自患者的静脉或足背的动脉来完成的，一般情况下即采用标准化的化学发光免疫分析法或者酶联免疫分析进行检测。

在分年龄性别等典型人群样本中，心肌损伤标志物的正常检测结果是在其对应的参考值范围内检测出来的。

在未受损肌肉的情况下，这些标志物通常不会存在于血液中。

当存在心肌损伤或心脏疾病时，这些标志物的水平就会升高，并由此反映心肌损伤的严重程度。

需要注意的是，不同的标志物在不同情况下对心肌损伤的敏感度和特异性不同。

科学合理地选择心肌损伤标志物的检测有助于提高诊断的准确度。

心肌损伤标志物检验是临床常规检查中的一个重要项目，可以用来监测心肌疾病的发展和处理效果。

通过对不同标志物的检测，可以更准确地判断病情的严重程度和预后。

心肌检测标志物_肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究

第38卷第2期东北师大学报(自然科学版)Vol.38No.2 2006年6月Journal of Northeast Normal University(Natural Science Edition)J une2006[文章编号]100021832(2006)022*******心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究马玉芹1,张淑华2,范丽颖2,董　龙3,钱海刚2,丘瑜敏2(1.长春理工大学材料与化工学院,吉林长春130022;2.长春理工大学生命科学学院,吉林长春130022;3.吉林大学环境科学与资源学院,吉林长春130021)[摘　要]　肌红蛋白主要存在于心肌和骨骼肌中,具有携带氧并将其分配到生物体各个部位的作用.研究表明,心血管病人发病早期,心脏中的肌红蛋白会大量释放入血,使其成为检测急性心肌梗死的良好标志物.采用HR100凝胶过滤层析和DEAE-52离子交换层析技术,从猪心中对肌红蛋白进行了分离与纯化,后经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,得到了纯化的肌红蛋白,并利用Ph.D-7噬菌体展示肽库试剂盒对肌红蛋白特异性亲和配体进行了筛选,最终得到其特异性亲和配体序列,从而使其试剂盒的研制与应用成为可能.[关键词]　肌红蛋白;HR100;纯化;肽库筛选[中图分类号]　Q513+.4 [学科代码]　180・1710 [文献标识码]　A0　引言肌红蛋白(myoglobin,MB)是肌组织所特有的一种单肽键蛋白质[1],主要生物学功能是结合氧并携带氧,是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质,在心肌中含量丰富.心肌蛋白是心肌细胞胞浆蛋白,相对分子质量为17800,它在早期心肌缺血的研究中早有报道[2-3].当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高.如心肌梗死发病后4～12h内,血清中肌红蛋白可达高峰,48h恢复至正常水平[4].因此,肌红蛋白成为近年来测定急性心肌梗死(AM I)的一项重要生物学指标.本文对心肌蛋白的分离纯化及配体筛选进行了具体研究,为其试剂盒的研制与应用打下了基础,使其临床诊断成为可能.1　材料与方法1.1　材料,仪器材料:新鲜猪心(市售).仪器:组织捣碎机,高速离心机,超声波破碎仪,SL-2层析柜,紫外检测仪,记录仪,TH-1000梯[收稿日期]　2005211221[基金项目]　吉林省科技发展计划项目(20030450).[作者简介]　马玉芹(1968-),女,博士研究生,副教授,主要从事环境生物学研究.度混合器,凝胶成像仪,电泳装置,超净工作台,干燥箱,高压灭菌锅,移液枪,分析天平,恒温培养箱等.低相对分子质量标准蛋白(购于上海生化试剂所),Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒(购于BioLabs 公司),Sephacryl HR100柱料(购于鼎国试剂公司),DEAE -52柱料(购于鼎国试剂公司),其他试剂购自鼎国、北京益利试剂公司(均为分析纯).1.2　方法1.2.1　组织提取物的制备将新鲜猪心与一定量的p H 为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液混合置于组织捣碎机中捣碎3min ,然后将匀浆物于高速离心机(10000r/min )中离心90min ,弃去沉淀,保留上清液.1.2.2　盐析沉淀上清液用1mol/L NaOH 调p H 至7.4,后将此上清液用80%的硫酸铵盐析沉淀,10000r/min 离心30min ,去上清,沉淀用少量磷酸盐缓冲液溶解,并置于透析袋中4℃透析过夜.1.2.3　Sephacryl HR100柱层析取一定量的透析液上Sephacryl HR100柱,控制流动相的流速,收集相对分子质量为10000～20000的蛋白质.然后将此蛋白提取液用聚乙二醇(PEG )浓缩,并用p H 值为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液透析过夜.峰1为高相对分子质量杂质峰;峰2为含肌红蛋白的峰;峰3为低相对分子质量杂质峰.图1　Sephacryl HR 100柱层析过程中样品吸光度变化情况1.2.4　DEAE -52柱层析将透析液上DEAE -52柱,然后采用线性梯度法进行洗脱,洗脱液为0～300mmol/L NaCl 和p H 值为8.5的10mmol/L Tris -HCl 缓冲液.分别收集不同峰值的蛋白组分.1.2.5　SDS -PA GE 电泳利用SDS -PA GE 电泳对上述各步骤、不同峰值获得的样品分别进行鉴定,经与标准蛋白相对照确定肌红蛋白所在的峰,并对其进行收集,冷冻干燥后得纯品肌红蛋白.1.2.6　Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选筛选步骤按Ph.D -7噬菌体展示肽库试剂盒的说明进行.具体为:将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板共同温育,先洗去未结合噬菌体,然后洗脱特异性结合的噬菌体.对洗脱的噬菌体进行扩增,然后再进行下一轮结合/扩增循环,以富集可结合序列.经3轮淘选后,通过DNA 测序对每个可结合克隆进行定性.2　结果与讨论2.1　结果2.1.1　Sephacryl HR100柱层析过程中洗脱液出峰情况在Sephacryl HR100凝胶层析过程中,流出液随时间延长其出峰情况如图1所示.分别收集各峰样品进行电泳.电泳结果表明,肌红蛋白存在于第二个峰中.收集第二峰,走DEAE -52离子交换柱,并收集不同峰值的蛋白组分,电泳结果表明,经离子交换后获得了纯的肌红蛋白(见图2).2.1.2　盐析、Sephacryl HR100柱层析及DEAE -52柱层析粗提液用80%的硫酸铵盐析沉淀后,离心去上清,对沉淀进行透析,并取样进行电泳,结果见图2.2.1.3　SDS -PA GE 电泳将粗提的样品、经硫酸铵处理的样品、经Sephacryl HR100柱层析的样品、经DEAE -52离子交换柱层析的样品进行电泳实验,结果见图2.511第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究从图2可知,粗提液中蛋白的种类较多(2泳道),蛋白之间不能很好分辨清楚;盐析样品中蛋白的种类有所减少(泳道3),电泳图谱较清楚;Sephacryl HR100凝胶样品中蛋白只剩两种(泳道4,样品未浓缩);经DEAE -52离子交换柱层析后的样品只留下一条带,表明已经纯化得到一种蛋白,且相对分子质量约为17800.1标准蛋白;2粗提液;3硫酸铵处理后样品;4Sephacryl HR100柱层析后样品(未浓缩);5,6,7DEAE -52柱层析后样品.图2　Sephacryl HR 100柱层析与DEAE -52柱层析电泳结果2.1.4　Ph.D -7噬菌体展示肽库筛选利用Ph.D -7噬菌体展示肽库对心肌蛋白的特异性亲和配体进行了三轮筛选,前两轮为非特异性筛选,第三轮为特异性筛选,结果如下:(1)第一轮洗脱物滴度为6.5×103个/μL ,收率为3.74×10-6;(2)第二轮洗脱物滴度为1.21×105个/μL ,收率为6.96×10-5;(3)第三轮洗脱物滴度为3.7×106个/μL ,收率为2.03×10-3.对第三轮洗脱物挑斑测序,得其特异性亲和配体序列为:Arg -His -Pro -His -Leu -Val -Ser.2.2　讨论肌红蛋白的相对分子质量约为17800,等电点为6.9.根据其两性蛋白质性质,本实验主要采取了盐析、凝胶层析与离子交换层析三种分离纯化方法.其中盐析法的采用非常必要,粗提液经80%硫酸铵沉淀后,绝大部分杂蛋白会变性,但肌红蛋白的活力没有受到影响.经过此步,部分杂蛋白被除去,样液体积也大大减少,便于后续操作.凝胶层析法主要是根据凝胶的分子筛效应,将相对分子质量大小不同的蛋白质相分离,本实验采用的Sephacryl HR100柱料理化性质稳定,且分离效率很高.实验结果表明,采用此柱料分离肌红蛋白效果较好.根据肌红蛋白表面的电荷效应,本实验采用DEAE -52离子交换柱料对其进行进一步纯化,离子交换后的电泳结果表明,利用DEAE -52纯化肌红蛋白是理想的,获得了肌红蛋白纯品.本文利用噬菌体展示肽库技术,以纯化的心肌蛋白为靶分子筛选其特异性亲和配体,三轮收率逐渐提高,第三轮洗脱物测序结果专一性较强,说明利用七肽库筛选结果较理想.3　结论肌红蛋白是第一个被确定的具有三级结构的蛋白质,主要生物学功能是结合氧[5],是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质.正常人的血液中肌红蛋白含量很少,当心肌或骨骼肌有损伤时,肌红蛋白便释放入血液中,使血中肌红蛋白明显增高,故肌红蛋白是用于心肌损伤检测的标志物[6].其对急性心肌梗死的检测具有重要的诊断意义.本实验主要是通过Sephacryl HR100凝胶层析和DEAE -52离子交换层析对匀浆、离心后的猪心进行分离纯化,每步纯化都经过SDS -PA GE 分析,结果证明,经过一系列分离纯化步骤可以得到电泳纯的肌红蛋白.噬菌体展示是一种体外筛选技术.噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA 编码序列之间建立了直接联系,使得各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning )的体外选择程序得以快速鉴定[7].本文以分离纯化的心肌蛋白为靶分子,利用噬菌体展示随机肽库进行了三轮筛选,最终获得专一性较强的亲和配体,这为心肌蛋白试剂盒的临床研制与应用提供了可能.611东北师大学报(自然科学版)第38卷[参　考　文　献][1]　闵建雄.肌红蛋白及其法医学意义探讨[J ].法学杂志,1998(5):89-94.[2]　KEN T S P.Diffusion of myoglobin in the diagnosis of early myocardial ischemia[J ].Lab Invest ,1982,46(3):265-270.[3]　NOMO TO K I ,MORI N ,SHOJ I T ,et al.Early loss of myocardial myoglobin detected immunohistochemically following occlusion ofthe coronary artery in rats[J ].Exp Mol Pathol ,1987,47(3):390-402.[4]　贺兆发,刘云宝,陆春风.急性心肌梗塞时血清肌红蛋白动态变化的动物及临床实验研究[J ].中国心血管病杂志,1996,24:392.[5]　孙京新,周光宏.猪肉中氧合肌红蛋白的分离纯化特征研究[J ].食品科学,2002,23(12):27-37.[6]　郑佐娅.心血管疾病的生化标志物[J ].诊断学理论与实践,2004,3(3):221-222.[7]　WDERSTEN M ,MANN ERVIK B.G lutathione transferases with novel active sites isolated by phage display from a library of randommutants[J ].J Mol Biol ,1995,250(2):115-122.The study on purif ication and aff inity ligand of myoglobin —a ne wmaker for detection of AMIMA Yu 2qin 1,ZHAN G Shu 2hua 2,FAN Li 2ying 2,DON G Long 3,Q IAN Hai 2gang 2,Q IU Yu 2min 2(1.College of Material and Chemical Engineering ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;2.School of Life Sciences ,Changchun University of Science and Technology ,Changchun 130022,China ;3.College of Environment and Resources ,Jilin University ,Changchun 130021,China )Abstract :Myoglobin is composed of a heme prosthetic group and a polypeptide chain (globin )which have 152residues.Myoglobin exists mainly in myocardium ,cardiac muscle and the skeletal muscle.Myoglobin can store and assign the oxygen to all over the cell and tissue of the creature.It is proved recently that myo 2globin can be used as a good biological marker for detection of acute myocardial infarction (AM I ).In this thesis ,obtained myoglobin from bovine heart muscle using Sephacryl HR100filtration chromatography and DEAE -Sephacel ion -exchange chromatography.After SDS -PA GE get the pure product.Myoglobin is a sensitive maker which can be used in diagnosis of the sudden death from myocardial ischemia.The specific sequence of affinity ligand was obtained with the Ph.D -7phage display peptide library kit.The results make it possible for clinical development and application of the kit.K eyw ords :myoglobin ;HR100;purification ;peptide library selection(责任编辑:方　林)711第2期马玉芹,等:心肌检测标志物———肌红蛋白分离纯化及亲和配体的研究。

心肌标志物

对于cTn作为一个特异性心血管指标用于临床对心肌梗死(MI)的诊断或急性冠脉综合症(ACS)的危险分层提出了对试剂的要求，如：检测的灵敏度，不精密度的要求，抗体必须检测cTn分子的稳定结构区域，没有嗜异性抗体的干扰，对样品没有抗凝剂(尤其是肝素)的要求，Cut-off 值设定在> 99%分位值，试剂在此值的不精密度<10%CV，检测的周转时间(TAT)要小于１个小时等。
与CK-MB相比，TnI、TnT对心肌损伤的诊断敏感性更高，特异性更强，持续时间更长。随着对心肌肌钙蛋白的深入研究，无论是对心肌的特异性还是敏感性，肌钙蛋白被认为是目前最好的确定标志物，它正逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。
NACB/IFCC/ESC/ACC关于cTn临床应用的建议对检测试剂有何要求？
临床实践中已陆续发现多种反映心肌损伤的标志物，包括心肌缺血损伤的标志物，如缺血修饰白蛋白、髓过氧化物酶、CD40配体等；心肌缺血坏死早期暨发病6小时内的标志物，如肌红蛋白、脂肪酸结合蛋白、糖原磷酸化酶 BB同工酶等。而AST、乳酸脱氢酶及其同工酶等因灵敏度和特异性都相对较差，在心肌损伤的诊断检测中已不再应用。
在考虑心肌梗死诊断时，心肌标志物检测结果的评价应结合临床表现（病史、体格检查）和心电图检查的结果。cTn或CK-MB质量的检测值高于参考范围上限值的ACS病人存在心肌损伤，结合相应的临床表现或心电图检测结果，可以考虑诊断为心肌梗死，属于高危险性。
肌钙蛋白（Tn）的基本结构
肌钙蛋白是横纹肌收缩的重要调节蛋白，平滑肌无肌钙蛋白。肌钙蛋白复合物由三个亚基组成：肌钙蛋白C（TnC）、肌钙蛋白T（TnT）和肌钙蛋白I（TnI）共同构成，参与由钙离子介导的肌肉收缩活动的调节。

心肌标志物检测项目(临床生物化学检验技术课件)

在诊断AMI时，HBDH的特异性高于LDH总活性，但不
及LDH1同工酶
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乳酸脱氢酶
➢ ①从乳酸氧化成丙酮酸的正向反应（LD-L法）
L-乳酸+NAD+ LDH 丙酮酸+NADH+ H+
在波长340nm处监测NAD+ 还原成NADH引起吸光度的升高速率，此升高速率与LDH活性成正比。 ➢ ②从丙酮酸还原成乳酸的逆向反应（LD-P法）
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主要内容
➢ 酶类心脏标志物
➢ 蛋白类心脏标志物 ➢ 心脏标志物的选择与评价
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天门冬氨酸转氨酶
➢ 分布
➢ 主要存在于肝脏、心脏、骨骼肌、肾脏。
➢ 同工酶
➢ 胞浆型(sAST)和线粒体型(mAST) ➢ c-AST升高与细胞膜的通透性改变有关，可作为炎症反
应的指标；m-AST与线粒体膜的通透性改变及细胞坏死密切相关，反映一些疾病的严重程度，可指导治疗及判断预后。
肌钙蛋白I在AMI诊断中的重要临床应用价值及评价。 ➢ 5.掌握BNP和NT- proBNP对心力衰竭的诊断价值和临
床应用。
2
概述
➢ 心脏的结构
➢ 心脏分为左心和右心，被房间隔和室间隔分开。
➢
左心室→主动脉→
毛细血管→下腔静脉→
右心房（体循环）。
➢
右心室→肺动脉→
肺泡毛细血管→肺静脉
→左心房（肺循环）。
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主要内容 ➢ 酶类心脏标志物
➢ 蛋白类心脏标志物
➢ 心脏标志物的选择与评价
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肌红蛋白
➢ 简介 ➢肌红蛋白（Mb或Myo）是存在于心肌和骨骼肌细胞胞浆中的亚铁血红素蛋白，主要生理功能是在肌肉组织中储存氧，在肌肉运动需要能量时供养给能。Mb无心肌特异性，在心肌和骨骼肌细胞中含量丰富，因其分子量小，仅为 17.8kD ， AMI时能迅速释放入血，具有高度的敏感性，是 AMI发生后出现最早的可检测标志物之一。

第十五章心肌标志物检验

第十五章心肌标志物检验概述心肌标志物检验是使用生物化学方法来检测心肌损伤的指标，通常用来协助诊断心肌梗死、心肌炎、心肌病等心血管疾病。

常见的心肌标志物包括肌钙蛋白、肌红蛋白、肌酸激酶等。

肌钙蛋白肌钙蛋白是目前应用最广泛的心肌标志物之一，能够敏感地反映心肌细胞损伤的程度。

在心肌细胞受到损伤后，钙离子会进入细胞内，刺激肌钙蛋白释放出来。

因此，在心肌梗死等情况下，肌钙蛋白的水平会显著升高。

肌钙蛋白检测是一项高度敏感的检验方法，通常使用免疫测定法进行检测。

常见的检测方法包括化学发光、免疫层析、酶联免疫吸附等技术。

肌红蛋白肌红蛋白是一种含有血红素的酸性蛋白，主要存在于心肌细胞、骨骼肌细胞等组织中。

当心肌细胞受到损伤时，肌红蛋白会释放到血液中，从而成为心肌损伤的指标之一。

肌红蛋白检测相对于肌钙蛋白，具有更短的半衰期，因此在开始损伤后能够更快地检测到心肌细胞的变化。

同时，肌红蛋白水平与心肌损伤的面积呈正比，因此在评估心肌梗死的严重程度时，肌红蛋白也是一项重要的检测指标。

肌酸激酶肌酸激酶又称为肌酸磷酸激酶，是一种存在于肌肉组织、心肌细胞中的酶类物质。

在心肌受到损伤后，肌酸激酶会释放到血液中。

肌酸激酶水平的升高能够提示心肌损伤的发生，但是肌酸激酶的半衰期比较长，因此在检测时要比肌钙蛋白和肌红蛋白稍微耗时一些。

肌酸激酶的检测主要采用酶动力学法、放射免疫等方法。

此外，近年来还有一些新型的心肌标志物开始得到应用，例如心肌特异性脂肪酸结合蛋白、高敏感性肌钙蛋白T等。

心肌标志物的检测是一种方便、可靠的方法来判断心血管疾病。

与传统的心电图、超声心动图检查相比，心肌标志物的检测更加敏感、稳定，能够更快地反映心肌损伤的情况。

因此，在心血管疾病的诊断和治疗过程中，心肌标志物的检测也变得越来越重要。

生物标记物的化学分离和分析技术

生物标记物的化学分离和分析技术生物标记物是指体内或体外存在的物质，能够反映机体健康状况、生理状态和疾病的发展程度，具有重要的生物学意义和临床应用价值。

化学分离和分析技术是生物标记物研究的重要手段，其发展对人类健康的保护和医学科学的进步具有重要意义。

一、生物标记物的特点和种类生物标记物具有起源单一、结构独特、代谢稳定、分布特异、含量丰富等特点。

根据其来源、性质和应用领域，可分为以下几类：1. 蛋白质类标志物：代表性标志物包括血清肌酸激酶、C反应蛋白、肌红蛋白等，可用于心脑血管疾病、肝肾功能损伤、恶性肿瘤等疾病的诊断和病情监测。

2. 核酸类标志物：代表性标志物包括微小RNA、DNA甲基化等，可用于肿瘤、心血管疾病等疾病的诊断和疗效观察。

3. 代谢物类标志物：代表性标志物包括葡萄糖、甘油三酯等，可用于糖尿病、高血脂等疾病的诊断和治疗。

4. 小分子类标志物：代表性标志物包括铁、钙、硒等微量元素，可用于贫血、疲劳症候群等疾病的诊断和治疗。

二、生物标记物的化学分离技术生物标记物的化学分离技术是生物标记物研究的重要手段之一，包括离子交换、亲和层析、凝胶过滤、透析等技术。

这些技术是将生物标记物与其他物质分离，集中、纯化，从而方便后续的分析和研究。

其中，离子交换色谱技术是一种基于物质的电荷差异进行分离的技术。

它可以将带电荷的物质与具有相反电荷的离子树脂分离，达到纯化的目的。

亲和层析技术是一种基于分子间结合力进行分离的技术。

它利用某些分子间的化学结合力，将目标分子与相应的亲和柱中的配体结合，经冲洗等步骤，将目标分子纯化。

凝胶过滤技术主要利用生物分子不同的分子量进行分离的技术，将生物分子按照大小分离。

透析技术是一种利用半透膜将分子按其分子量和分子性质进行分离的技术。

三、生物标记物的化学分析技术生物标记物的化学分析技术主要包括光谱分析、电化学分析、质谱分析等。

这些技术是将化学分离得到的生物标记物进行解析和定量，为研究生物标记物提供了重要的依据。

牛心肌肌钙蛋白T的分离纯化和单克隆抗体的制备

牛心肌肌钙蛋白T的分离纯化和单克隆抗体的制备摘要：牛心肌肌钙蛋白T（cTnT）是心肌细胞的特异性标记蛋白，对心肌病的诊断和治疗具有重要意义。

本研究旨在对牛心cTnT进行分离纯化，并制备其单克隆抗体。

首先采用盐析法和离子交换层析法分离牛心肌细胞中的cTnT，再通过凝胶过滤层析和反渗透层析进行纯化，纯化后的cTnT样品经过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting证明其纯度达到95%以上。

然后采用脊髓灰质炎病毒（SPV）作为细胞激素并免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术产生单克隆抗体，共筛选出5株具有特异性、高效价、纯度高的单克隆抗体。

最后对这些单克隆抗体的特异性进行验证，结果表明，这些单克隆抗体对cTnT具有较高的特异性和亲和力。

这些分离纯化和单克隆抗体的制备研究结果将为心肌病的诊断和治疗提供有力的支持。

关键词：牛心肌肌钙蛋白T；分离纯化；单克隆抗体；心肌病；诊断。

Introduction：心肌病是指由于多种原因导致的心肌结构、功能发生改变的疾病。

心肌细胞中的cTnT是心肌细胞的特异性标记蛋白，其在心功能调节和心肌病诊断中具有重要意义。

为了提高对心肌病的诊断和治疗水平，分离纯化和制备高特异性、高亲和力的单克隆抗体成为了研究的重点。

Methods：1.牛心cTnT的分离纯化采用盐析法和离子交换层析法分离牛心肌细胞中的cTnT，用凝胶过滤层析和反渗透层析进行纯化，纯化后的cTnT样品经过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting证明其纯度达到95%以上。

2.单克隆抗体的制备采用脊髓灰质炎病毒（SPV）作为细胞激素并免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合技术产生单克隆抗体，共筛选出5株具有特异性、高效价、纯度高的单克隆抗体。

Results：通过Western blotting和SDS-PAGE凝胶电泳结果表明，纯化后的cTnT样品纯度达到95%以上；通过ELISA方法和Western blotting结果验证了单克隆抗体对cTnT的特异性，这些单克隆抗体亲和力较高，可用于心肌病的诊断。

心肌标志物三合一胶体金免疫层析法的性能评价

心肌标志物三合一胶体金免疫层析法的性能评价发表时间：2014-04-02T15:32:24.577Z 来源：《中外健康文摘》2013年36期供稿作者：邹超世1 谢钰玲2 梁建华1 吴鹏[导读] 胶体金免疫层析法能更早期、方便地对心肌梗死进行筛查和诊断，及时干预治疗因而便于在临床推广，特别是基层医院。

邹超世1 谢钰玲2 梁建华1 吴鹏3（ 1 广西玉林市第一人民医院检验科 537000）（ 2 广西玉林市妇幼保健院检验科 537000）（ 3 广西玉林市第一人民医院心内科 537000）【摘要】目的分析评价三联合一胶体金法心功酶检测卡临床检测性能。

方法以化学发光法为相对标准，从灵敏度、特异度、重复性、检出限等方面评价某国产三联合一胶体金法检测卡测定血清肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 和肌钙蛋白I(cTnI) 的临床检测性能。

结果与化学发光法比较，胶体金法所测CK-MB，Mb 和cTnI 的相对敏感度分别为45.7%，37% 和65.7%。

相对特异度分别为88.8%，95.2% 和90.7%，相对准确度分别为88.7%，83% 和94.1%。

检测卡最适标本量为120ul，观察结果最佳时间为10m in，检测结果在20m i n 之内稳定。

该方法重复性良好，实验不受溶血、脂血的干扰。

结论心肌标志物三合一胶体金法的特异度和准确度相对较好，但敏感度偏低。

作为心肌标志物的急诊检测方法，国产试剂有必要进一步提高其临床检测性能。

【关键词】胶体金法心肌梗死性能评价【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）36-0030-03目前，心血管疾病严重威胁着人类的健康，是造成人类死亡的主要原因之一[1-2]。

目前用于心肌梗死诊断的主要心肌标志物包括肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB) 和肌钙蛋白I(cTnI)[3-4]，检测方法主要为免疫分析法、化学发光法，胶体金免疫层析法等[5]。

心肌标志物实验室检测及临床应用

1 .急性心肌梗死 (AMI)
临床应用
心肌梗死发生后3~8h，血清CK开始上升，可高达正常上限的10~ 12倍，较少超过30倍，10~36h达到高峰， CK 对心肌梗死诊断较AST、LDH 的特异性高, 但此酶增高的持续时间较短, 2~ 4 d 就恢复正常。 CK活性测定有助于心肌梗死病人的早期诊断，其增高的程度与心肌损坏的程度基本一致。在AMI病程中，如CK再次升高，表明心肌再次梗死。溶栓治疗后心肌再灌注时，CK活性成倍增加。
Mb 对AMI 的阴性预测值高达100%
2、急性心肌梗死溶栓治疗
溶栓治疗后，溶栓成功者, Mb会出现一较小新峰, 并在溶栓后2h 明显下降提示再灌注成功。
3.判断再梗死由于M b 回复快, 故为判断再梗死的良好指标, 优于cTnI和CKMB, 通常再梗死者动态观察Mb 将出现新峰。
4、骨胳肌损伤
肌酸激酶(CK)活性自从1967年成功地发现CK 对心肌和肌肉病变有显著的诊断价值, CK 就成为检测心肌损伤的标志物, 时至今日CK 的升高还是诊断人类肌病的最敏感的方法。
主要存在于骨胳肌、心肌和脑组织的胞质和线粒体中。CK催化肌酸与ATP之间高能磷酸键转换生成磷酸肌酸和ADP的可逆反应，为肌肉收缩和运输系统提供能量来源。健康人血清中CK含量甚低，当上述组织受损时，CK进入血液中，使其CK活性明显升高。
CK-MM
CK-BB
主要存在于脑、前列腺、肠、肺、膀胱、子宫、胎盘及甲状腺中。
变化规律---CK和CK-MB在AMI发生后4~6小时即可超过正常上限，24小时达峰值，48~72小时恢复正常。
正常上限
4-6h 24h
在20世纪60~70年代，CK-MB成为世界上应用最广泛的心肌损伤指标。不但可以早期诊AMI，也可以估计梗死范围大小或是否再梗死。

心脏生物标志物肌红蛋白的生物传感检测方法

心脏生物标志物肌红蛋白的生物传感检测方法余文;刘灵芝;谢国明【摘要】急性心肌梗死(AMI)有极高的发病率和病死率.心肌损伤标志物肌红蛋白在心肌梗死后1小时内便开始升高,是AMI发生后最早可检测的标志物之一.本文重点综述了基于纳米增强比色、局域表面等离子共振、荧光和电化学分析构建的肌红蛋白检测生物传感新方法,探讨了各类方法的优缺点及其在AMI即时检测和早期诊断中的应用.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】8页(P1-8)【关键词】急性心肌梗死;肌红蛋白;生物传感【作者】余文;刘灵芝;谢国明【作者单位】重庆医科大学检验医学院,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,重庆400016【正文语种】中文综述急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI) 起病急，病情凶险，死亡率高。

心电图是经典的用于诊断心脏疾病的方法，但心电图诊断AMI的阳性率仅为80%，灵敏性不够高，而且心肌梗死早期不会发生心电图特征性改变。

另外，心电图不能诊断出非ST段抬高型心肌梗死，易导致临床抢救不及时，造成严重后果。

因此，为克服心电图的局限性，心肌损伤标志物被广泛用于心肌梗死的诊断。

肌红蛋白(myoglobin，Mb)作为AMI发生后最早可检测的标志之一，在AMI发生后1小时内便开始释放入血，是目前应用最早的心肌损伤标志物。

虽然Mb的特异性不高(如肌肉损伤时，Mb也会升高)，但从病史和临床表现以及与其他指标联合诊断，能很好地鉴别出AMI，并且AMI患者Mb 的阳性率为92%[1]。

此外，Mb的阴性预测价值达100%，即在疑似发生AMI的病人中，2h内Mb在正常范围，基本可以排除AMI。

另外，Mb还可用于判断再梗死[2]。

因此检测Mb具有重要的临床意义。

一般将血清Mb浓度100ng/mL作为医学临界值。

传统的Mb的检测方法如ELISA、荧光免疫分析、化学发光分析等操作繁琐，分析费时，且需要大型分析仪器，多需要将样本送到实验室或检验科进行检测，耗时，容易延误病情(表1)。

心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选

心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选
心肌型脂肪酸结合蛋白特异性亲和配体的筛选
心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种低相对分子质量的蛋白质,其相对分子质量为14 000～15 000,在心肌中含量丰富.H-FABP在脂肪酸的运输、脂类的代谢、调节细胞增殖与分化等方面具有重要的作用,是检测急性心肌梗塞(AMI) 的有效生物学标志物.以H-FABP为靶标,采用噬菌体表面展示随机十二肽库对H-FABP的特异性亲和配体进行了筛选,经四轮筛选得到一个ELISA检测阳性特征序列: W-P-H-Q-K-L-H-L-M-R-H-S,为临床检测急性心肌梗塞提供了一种新的方法.
作者：张淑华范丽颖马玉芹于源华徐镜波ZHANG Shu-hua FAN Li-ying MA Yu-qin YU Yuan-hua XU Jing-bo 作者单位：张淑华,ZHANG Shu-hua(东北师范大学城市与环境科学学院,吉林,长春,130024;长春理工大学生命科学技术学院,吉林,长春,130022) 范丽颖,于源华,FAN Li-ying,YU Yuan-hua(长春理工大学生命科学技术学院,吉林,长春,130022)
马玉芹,徐镜波,MA Yu-qin,XU Jing-bo(东北师范大学城市与环境科学学院,吉林,长春,130024)
刊名：东北师大学报（自然科学版）ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHEAST NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 38(4) 分类号：Q513 关键词：心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP) 噬菌体展示肽库亲和配体。

心肌损伤标志物的实验室诊断评价及临床应用研究进展

心肌损伤标志物的实验室诊断评价及临床应用研究进展【关键词】心肌损伤标志物实验室诊断临床应用研究进展急性心肌梗死(AMI)是临床常见的急性心血管疾病，严重危害人们的生命健康，对AMI的诊断研究一直备受医学界关注。

AMI患者中约1/4早期没有典型的临床症状，约50.0%没有特异的心电图改变，因此心肌标志物的实验室检测在AMI的诊断中就有了相当重要的地位。

但AMI患者病情进展急而实验室检测时间长以及无特异性的指标一直是困扰我们的问题，经过数十年的研究探讨，心肌标志物的实验室检测在项目组合、实验方法、检测时间上都有了重大突破，本文对其研究进展及临床应用情况做一综述。

1 血清酶标志物的早期研究(AST、CK-MB、 CK)AMI生化标志物的研究早期集中于血清酶标志物。

AMI血清酶标志物的研究始于1954年，Karman等运用较为敏感的纸色谱法定量，测定AMI患者血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性，AMI患者血清AST升高，成为AMI的第一个血清酶标志物。

血清AST有两种受不同基因控制的同工酶，分别存在于细胞质(c-AST)和线粒体(m-AST)内。

AST升高有临床意义;后来发展到同时检测肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB);AST、CK、CK-MB成为传统的诊断AMI的血清标志物，但其特异性不高，某些疾病可导致假阳性，如肝脏疾病、心肌疾病、心肌炎、骨骼肌创伤、肺动脉栓塞、休克及糖尿病均可影响其特异性。

2 心肌组织损伤及坏死标志物以往对于心肌梗死生化诊断指标主要是AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB 活性等酶学指标，那么在多年的实验过程中得出：AST、LDH、α-HBDH、CK等，因灵敏度和特异性都相对较差所以在心肌损伤的诊断中逐渐应用减少或已不再应用。

近年来研究认为心肌肌钙蛋白CTnI或CTnT、CK-MB和肌红蛋白(MB)是心肌的3种特异性蛋白成分，对心肌损伤有高度的特异性和敏感性，肌钙蛋白由3个亚单位组成，它们各自有独立的结构和不同的调节作用，心肌肌钙蛋白在钙离子参与下调节介导肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应，从而维持心肌的舒张与收缩。

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ

亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白Ⅰ马宏伟;赵卫国;潘柏申【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2007(022)003【摘要】目的从人心肌组织提取纯化心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI).方法采用离子交换层析和疏水层析从兔骨骼肌中提纯肌钙蛋白C(TnC),制备连接有TnC的亲和层析介质,通过亲和层析法从人心肌组织中直接提纯cTnI.纯化的cTnI采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法进行鉴定.结果从10 g人心肌组织中共提纯2.44 mg cTnI,SDS-PAGE图上显示为单一条带,表观相对分子质量约为29 000.免疫印迹法结果表明cTnI单克隆抗体能够特异性识别提纯的cTnI,纯化的cTnI SDS-PAGE和免疫印迹法结果均与商品化cTnI结果一致.结论具有免疫活性的天然cTnI的获取有助于急性心肌梗死诊断试剂盒的研制.【总页数】4页(P304-307)【作者】马宏伟;赵卫国;潘柏申【作者单位】复旦大学附属中山医院检验科,上海,200032;上海交通大学医学院医学检验重点实验室,上海,200023;复旦大学附属中山医院检验科,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】R446.1【相关文献】1.用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用 [J], 吴光辉;王庆;巩华;石存斌;李华;吴淑勤2.亲和层析法分离纯化纳豆激酶 [J], 刘柳;李南薇;郭勇3.亲和层析法分离纯化蒜氨酸酶 [J], 吴熙然;胡红华;张相年;赵树进4.亲和层析法分离纯化油茶籽多糖Ⅰ的研究 [J], 王海林;王春艳;谢长林;文汉5.亲和层析法提取纯化人心肌肌钙蛋白I [J], 马学华;刘忠英;张萱;胡秀丽;姜熙罗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。