血啉甲醚对单增李斯特菌的光动力灭活作用及机理

血啉甲醚对单增李斯特菌的光动力灭活作用及机理*林少玲1,唐书泽1,唐姝姝1,吴希阳1,陈振强21(暨南大学食品科学与工程系,广东广州,510632) 2(暨南大学光电工程系,广东广州,510632)摘 要 通过平板菌落计数法研究血啉甲醚对单增李斯特菌的光动力灭活作用,同时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚合酶链式反应分析光动力灭菌技术对单增李斯特菌蛋白降解效果和基因组DNA 的损伤程度。

实验发现浓度为25 g /mL 的血啉甲醚在光功密度为200m W /c m 2的溴钨灯光照射30m i n 杀灭了99 9999%的单增李斯特菌,并导致了其蛋白质降解和基因组DNA 片段断裂。

血啉甲醚对单增李斯特菌的光动力灭活作用非常显著,其灭活机理可能是通过对蛋白质降解和基因组DNA 损伤实现的。

关键词 血啉甲醚,光动力灭菌技术,单增李斯特菌,蛋白质降解,脱氧核糖核酸损伤第一作者:硕士研究生(唐书泽教授为通讯作者)。

*广东省食品安全应急技术研究课题(0815)。

收稿日期:2010-11-21,改回日期:2010-12-24光动力技术是指生物组织中的光敏物质受到相应波长光照后,吸收光子能量,由基态跃迁到激发态,并迅速退激释放能量而返回基态的过程。

该过程能够生成大量活性氧,活性氧与多种生物大分子相互作用,从而损伤细胞结构或影响细胞功能[1-2]。

在医学上,利用光动力反应进行疾病诊断和治疗的技术称之为光动力疗法(pho todyna m ic therapy ,PDT ),目前主要用于恶性肿瘤和皮肤癌的治疗[3],在血液制品消毒等方面的作用也得到了广泛认同,其安全性也得到了较为详尽的论证[4-5]。

光动力灭菌技术(anti m icr obia l photodyna m ic techno l o gy ,APDT)是在光动力技术的基础上,利用光敏剂对细菌的优先聚集特性,在适当波长的光激发下,使光敏剂吸收能量后产生单线态氧、自由基等活性氧物质进而通过氧化作用杀伤微生物,而不伤害周围组织和细胞的一项新技术[6]。

抗生素是目前抑制或杀灭病原微生物的主要手段,但近年来随着抗生素滥用导致了诸如 超级细菌 爆发等事件的不断出现,使人们开始寻找抗生素之外有效且安全的抑菌或杀菌方法[7]。

APDT 已被证实具有显著的杀伤耐药菌的作用[8],本课题组前期研究已证实其对曲霉孢子[9]、金黄色葡萄球菌[10]、蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌[11]具有很好的光动力灭活作用。

单核细胞增多性李斯特菌(L isteris a m onocy togenes),简称单增李斯特菌,是近年来受到特别关注的一种食源性致病菌。

在加拿大、美国和欧洲,肉类食品单增李斯特菌食物中毒案例时有报道,感染后发病致死率高达25%以上[12]。

随着我国肉类消费大幅增加,尤其是对冷鲜肉食品的消费,呈迅速上升趋势,肉类食品单增李斯特菌污染导致的潜在食物中毒将更加受到关注。

本实验选用单增李斯特菌为实验菌株,研究血啉甲醚(he m atoporyrin m ono m et h y l e ther ,HMME )作为光敏剂对单增李斯特菌的APDT 灭活效果,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sod i u m dode cy l su l p hate po l y acr y la m i d e ge l electrophoresis ,SDS PAGE)和聚合酶链式反应(poly m erase cha i n reaction ,PCR )技术分析HMM E 对单增李斯特菌菌体蛋白和基因组DNA 的光动力影响,探讨光动力灭菌技术的作用机理。

1 材料和方法1 1 材料1 1 1 菌株单增李斯特菌,广州市疾病预防控制中心。

1 1 2 培养基细菌计数培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soy broth ,TSB ),青岛海博生物技术有限公司。

1 2 主要试剂和仪器血啉甲醚(10m g /mL ,批号980225),上海第二军医大学五二三药物研究室;U 21901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;75W 溴钨灯(光源光功密度为200mW /c m 2),北京卓立汉光仪器有限公司;TaqM i x 和细菌基因组DNA 快速提取试剂盒,广州东盛生物科技有限公司。

1 3 引物合成依据文献[13]针对单增李斯特菌hly A 全基因序列,利用pri m er5 0设计引物,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成,其序列如下:上游引物5' TGC AAG TCC TAA GAC GCC A 3下游引物5' CAC TGC ATC TCC GTG GTA TAC TAA 31 4 单增李斯特菌的光动力灭活试验1 4 1 菌株培养及前处理将活化的单增李斯特菌接种于TSB培养液中, 37 振荡培养至对数期,离心收集菌体(4000r/m in, 10m i n),弃上清液,重新悬浮菌体于0 1m o l/L的磷酸缓冲溶液(PBS)中,使其OD600=0 05(相当于107 CFU/mL左右)。

1 42 HMME浓度试验在96孔细胞培养板中(任取1孔)加入已处理好的200 L菌悬液,并加入不同浓度HMME,使其终浓度分别为1,5,10,25和50 g/m L,37 避光孵育30m i n,放在距离溴钨灯光源20c m处照射30m in 后进行平板计数(L+S+)。

同时设置不光照和\或不加HMM E组作为对照(L-S-;L+S-;L-S +)。

1 4 3 光照时间试验按照1 4 1方法处理单增李斯特菌后,在96孔板中(任取1孔)各加入200 L菌悬液并加入HMME,使其终浓度为25 g/m L,37 避光孵育30 m in后放在距离溴钨灯光源20c m处照射5,10,20和30m in后进行平板计数(L+S+)。

同时设置不光照和\或不加HMME组作为对照(L-S-;L+S-; L-S+)。

1 4 4 细菌菌落平板计数1 4 2和1 4 3中不同处理方式所得的菌悬液均以1 10梯度稀释后涂板于细菌计数培养基平皿中,于37 生化培养箱中恒温培养,24h后取出进行菌落计数。

实验重复3次,取平均值。

1 5 单增李斯特菌菌体蛋白降解和基因组DNA损伤试验1 5 1 菌株培养及前处理按1 4 1的方法培养单增李斯特菌,离心收集菌体(4000r/m in,10m i n),弃上清液,重新悬浮菌体于PBS,使其OD600=0 05,在96孔板中(任取4孔),每孔加入200 L菌悬液并加入HMME,使其终浓度为25 g/mL,37 避光孵育30m i n后,放在距离溴钨灯光源20c m处照射30m i n(L+S+)。

同时设置不光照和\或不加HMME组作为对照(L-S-;L+S-;L-S+)。

1 52 SDS PAGE分析菌体蛋白降解试验1 5 1中4组实验所得的各800 L菌悬液置于EP管中,离心弃上清液后(10000r/m in,2m i n)。

加入20 L无菌去离子水重悬菌体,5 L4 SDS PAGE上样缓冲液,95 加热5m in后进行SDS PAGE电泳。

1 5 3 PCR分析基因组DNA断裂试验1 5 3 1 单增李斯特菌基因组DNA的提取将1 5 1实验所得的4个实验菌株进行基因组DNA的提取,单增李斯特菌基因组DNA抽提按照试剂盒说明书进行,抽提所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳并作为PCR检测h l y A基因的模板。

1 5 32 单增李斯特菌h l y A基因片段PCR扩增使用hly A基因的上下游引物检测上述4组单增李斯特菌基因组DNA的断裂情况,PCR反应体系如下:单增李斯特菌基因组DNA模板1 L;2 PCRM ix10 L;上游引物1 L;下游引物1 L;dd H2O7 L; PCR反应条件:95 预变性5m in;95 变性30s, 56 退火30s,72 延伸30s,30个循环;最后72 延伸5m i n,反应结束,PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1 6 统计分析结果以均数 标准差表示,用GraphPad Pris m5所带的统计软件进行统计学处理。

差异显著性采用t 检验,P<0 05为显著差异。

2 结果与讨论2 1 HMME浓度对单增李斯特菌光动力灭活作用的影响HMM E在0~50 g/mL内对单增李斯特菌的光动力灭活作用见图1和图2。

从图1、图2中可以看出,随着光敏剂HMME浓度的增加,对单增李斯特菌的光动力灭活作用逐渐增强。

当HMME浓度低至1 g/mL的情况下,光照30m i n即可使约90%的单增李斯特菌灭活。

当HMME浓度达到50 g/m L时,几乎可完全使单增李斯特菌灭活。

而光照对照组及光敏剂对照组,均未显示出明显的杀伤作用。

[0]表明一定浓度的HMME在光照情况下对单增李斯特菌有较好的杀伤作用。

图1 不同浓度HMM E对单增李斯特菌菌落数(CFU)的影响图2 不同浓度HMM E对单增李斯特菌失活率的影响2 2 光照时间对单增李斯特菌光动力灭活作用的影响图3和图4显示了HMME浓度在25 g/mL时,光照时间对单增李斯特菌的光动力灭活作用的影响。

光照10m in以上,均能使菌落总数降低2个数量级以上,即99%以上的单增李斯特菌被灭活;当光照时间达到30m i n时,几乎可以完全杀伤单增李斯特菌,灭活率达到99 9999%。

表明HMME在一定浓度下,光动力杀菌技术对单增李斯特菌的光动力杀伤作用随着光照时间的延长而加强。

图3 不同光照时间的HMM E对单增李斯特菌菌落数的影响2 3 HMME APDT对单增李斯特菌细菌全蛋白降解效果的影响图4 不同光照时间的HMM E对单增李斯特菌失活率的关系HMM E APDT对单增李斯特菌细菌全蛋白的降解作用见图5,其中条带M是蛋白质分子量标准(6 5~175ku),条带1是光敏剂进行光照的不带菌空白条带,条带2是不加光敏剂直接进行光照的光照对照组,条带3是不加光敏剂并且不光照的完全对照组,条带4是加光敏剂并且进行光照的实验组,条带5则是加光敏剂不光照的光敏剂对照组。

从图中可以明显看出,单增李斯特菌在光敏剂HMME(25 g/mL),光照30m in的情况下,其菌体大部分蛋白被降解,只在20ku处有一降解不完全的条带。

而光照对照组及光敏剂对照组与完全对照组相比较,蛋白条带无明显变化。

图5 HMM E APDT处理后细菌全蛋白SDS PS GE图谱注:M:蛋白质分子量标准(6 5~175ku);1:S+L+;2:S-L+;3:S-L-;4:S+L+;5:S+L-;L=光照30m i n;S=样品添加光敏剂HMM E(25 g/mL)2 4 HMME-APDT对单增李斯特菌DNA全基因组损伤效果影响HMM E-APDT对单增李斯特菌基因组DNA的影响见图6,其中条带1是不加光敏剂直接进行光照的光照对照组,条带2是不加光敏剂并且不光照的完全对照组,条带3是加光敏剂并且进行光照的实验组,条带4则是加光敏剂不光照的光敏剂对照组。