不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响
冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究
义（ Ｐ＜００ ） Ｄ组 与 其 他 ３ 卵 母细 胞 冷 冻 保存 后 卵子 复苏 率 、 胎 受 精 率 、 续 发 育 潜 能 的 比较 ， 异 无 统 计 学 ．１ ； 组 胚 继 差
４种玻璃化冷冻载体都是小 鼠卵母 细胞 快速玻璃 化冷冻保存 中可行的冷冻 载体 ， 自制叶
片组 的卵 子 回收 率 明显 低 于 其 他 ３组 ， 更 进 一 步熟 练 叶片 制 作 的 技术 和实 验 人 员 操 作技 能 。 需
宁夏 医学 杂 志 ２ １ ０ １年 ９月 第 ３ ３卷第 ９期
Ｎｎｘ ｅ ，ｅ． ０ １ Ｖ ｌ ３。ｏ９ ｉｇｉ Ｍ ｄＪＳ ｐ２ １ ， ｏ ３ Ｎ ． ａ
文章编号： ０ — ９９２１） —８６ ０ １ １ ５４（０１０ ００ —３ ０ ９
・ 论
著 ・
冷 冻 载 体 对 小 鼠 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 效 果 影 响 的 研 究
自从 Ｗｈｔｎｈｍ 等 （ ９２ 和 Ｗｉ ｕ （ ９２ ｉｉ ａ ｔｇ １７ ） ｌ ｔ １７ ） ｍ 首次报道冷冻 一 解冻 小 鼠胚 胎成功 以来 ， 采用 快速玻
璃化冷冻法冷冻小 鼠卵母 细胞 ， 给人类 卵子 的冷冻提
周 昆明雄性 小 鼠共 ３ ０只（ 自宁夏 医科 大学 动物 实 购
验 中心 ， 普通 级 ） 。
１２ 仪 器 ： 视 显 微 镜 （６ ． 体 Ｓ Ｅ标 准 型 ， ｌ ｐ ｓＪ— Ｏｙ ｕ ，ａ ｍ ｐｎ 、 ａ ） 倒置 显 微镜 （ Ｘ １ Ｊｐ ｎ 及 显 微 注射 操 作 仪 Ｃ ２ ，ａ ａ ）
（ Ｉ Ｇ ｒ ａ ） Ｃ ２培 养 箱 （ ａ ｏ ｃ， ２ ０ Ｇ ｒ Ｒ ， ｅｍ ｎ ， Ｏ Ｌ ｂ ｔ ｔ Ｃ ０ ， ｅ— ｅ ｍ ｎ ， 养 皿 （ ａ ｏｓ Ｕ Ａ） 四孑 培 养 皿 （ ｕ ｓ ａ）培 Ｆｌ ｎ ， Ｓ ， Ｌ ｃ Ｎｎ，
小鼠精子胚胎冻存保种
小鼠精子胚胎冻存保种
将活体品系保存于液氮中，减低活体保种的费用、表型丢失、繁育能力下降等风险。
做到随用随取的快捷操作方式。
胚胎冻存
方法：将超排后的雌鼠与目的雄鼠进行交配，第二天取2细胞进行慢速冷冻，存放于液氮中。
优势：慢速冷冻的胚胎复苏后成活率高（80%以上），且移植后的大小鼠怀孕率及产仔率高。
缺点：操作难度高，需要高昂的程序冷冻仪，操作时间达到6个小时。
精子冻存
方法：将雄鼠处死取出精子通过快速冷冻保存于液氮中
优势：操作速度快，精子保存量大。
缺点：复苏时需要进行体外受精，且受精率低（一般为15%-25%）。
操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响
Journal of China-Japan Friendship Hospital,2019Oct,Vol.33,No.5中日友好医院学报2019年第33卷第5期293操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响韩烁，周雯慧，李媛(首都医科大学附属北京朝阳医院生殖医学中心，北京100020)摘要目的：探讨操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响。
方法：应用超促排卵技术获得小鼠卵母细胞，体外培养后受精，继续培养胚胎至囊胚期。
观察在不同的操作台温度下小鼠卵母细胞的受精及胚胎的发育情况。
结果：卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C,两原核形成率(2PN率)和囊胚形成率分别为89.82%和41.66%,显著低于操作台温度为37.0±0.2°C的2PN率96.25%(Pv0.05)和囊胚形成率57.50%(P<0.05)o胚胎培养期操作台温度升高至38.0±0.2°C,受精率、卵裂率和囊胚形成率与操作台温度为37.0±0.2°C时期的受精率、卵裂率和囊胚形成率无显著差异。
结论：卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C会降低小鼠卵母细胞2PN受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率，提高异常受精率。
胚胎培养期操作台温度升高对小鼠卵母细胞受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率无影响。
关键词：胚胎；发育；温度中图分类号：Q954.43文献标识码：A文章编号：1001-0025(2019)05-0293-03doi：l0.3969/j.issn」001-0025.2019.05.008Effect of different operating table temperature on fertilization and embryonic development of mouse oocytes//HAN Suo,ZHOU Wen-hui,LI Yuan//Journal of China-Japan Friendship Hospital,2019Oct,33(5):293-295Abstract Objective:To investigate the effect of different operating table temperature on fertilization and embryonic development of mouse oocytes.Methods:Mouse oocytes were obtained by hyper-ovulation and fertilized in vitro, then the embryos were cultured to blastocyst stage.The fertilization of mouse embryo oocytes and the development of the embryos were observed at different operating table temperatures.Results:When temperature of the operating table increased to38.0±0.2°C,the pro-nucleate stage(2PN)rate and blastocyst formation rate were89.82%and41.66%,respectively.Both rates were significantly lower than those when temperature was37.0±0.2°C,which were96.25%and57.50%,respectively(both P<0.05).There were no significant differences infertilization rate,cleavage rate and blastocyst formation rate between the above mentioned stage temperatures at the stage during embryo culture period.Conclusion:Increasing the operating table temperature to38.0±0.2°C during oocytes collection can decrease the fertilization rate of2PN,cleavage rate and blastocyst formation rate, and increase the abnormal fertilization rate.There were no effects on fertilization rate,cleavage rate and blastocyst formation rate when the temperature of operating table increased during embryo culture.Key words embryo；development；temperatureAuthor's address Medical Center for Human Reproduction,Beijing Chaoyang Hospital,Capital Medical University,Beijing100020,China卵母细胞体外受精及胚胎发育对生长环境有严格的要求，温度是重要的一个关键影响因素叫人的基础体温是37°C,所以最适宜卵母细胞成熟及胚胎发育的温度是37°C O但是在卵母细胞体外受精和胚胎发育的实际操作过程中，操作环境很难保持恒定的37°C,为了保证实验室人员的正常基金项目：首都医科大学科研培育基金(118208150802)=作者简介：韩烁(1989-),女，研究实习员。
小鼠卵巢玻璃化冻存不同时段FSH干预对Cx43表达的影响
用 。为此 ， 研 究 在 玻 璃 化 冻 存 的 不 同 环 节 中 ， 本 以 Ｆ Ｈ进 行 干 预 ， Ｓ 通过 检 测 Ｃ ４ ｘ ３的 表达 ， 观察 Ｆ Ｈ对 Ｓ
下 每 张切 片任选 ５个 视野根 据 卵 泡形 态 的 正常 与 否
ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆＣ ４ ｒ ｍ ｉｈ ｔ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｘ ３ ｆｏ ｈ ｇ ｏ ｌ ｗ ｉ ｕ ｎ Ｗ Ｓ ＯＧ —Ｆ Ｈ ，Ｆ —Ｆ Ｈ，Ｌ —Ｆ Ｈ，Ｃ ａ ｄ ＶＣ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ Ｓ Ｇ ｎ Ｇ，ｒｓ ｅ ｔ ｅｙ ｈ ｒ ｅ ｅ ｓｇ ｉ ｃ ｎ ｅ ｐ ｃｉ ｌ ，ｔｅ ｅ ｗ ｒ ｉｎ ｆ ａ ｔ ｖ ｉ
Ｆ Ｈ ｉ ｅ ｖｒ ｌ ｒｃｓ ｏ ｖ ｒ ｃｔｎ（ Ｇ—Ｆ Ｈ） ｉ ｔｅｆ ｎ ｒｃｓ ｏ ｖ ｒ ｃｔ ｎ（ Ｇ—Ｆ Ｈ）ａｄｉ ｅｌｅ ｒｃｓ ｉｉ Ｓ ｎｔ ｅａ ｏｅｓ ｆ ｉ ｆ ａｏ Ｏ ｈｏ ｌ ｐ ｔｉ ｉ ｉ Ｓ ，ｎ ｈ ｏｔ ｏｅｓ ｆ ｉ ｆ ａｏ Ｆ ｒ ｐ ｔｉ ｉ ｉ Ｓ ｎ ｔ ｔ ｐｏｅｓ ｆ ｔ— ｎｈ ａｒ ｏ ｖ ｒ
２ １ 年 ９月第 ３ ０２ ４卷第 ９ 期
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８ ７・ ２
文章 编 号 ：０ １— ９ ９ ２ １ ） ９— ８ ７— ３ １ ０ ５ ４ （ ０ ２ ０ ０ ２ ０
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论
著 ・
小 鼠 卵巢 玻 璃 化 冻存 不 同时 段 Ｆ Ｈ 干 预 对 Ｃ４ Ｓ ｘ ３表 达 的 影 响
ｒ ｓｒ ｃ ］ ｏｂｅ ｔｖ Ｔ ｎ ｕ ｈ ｅ ｔｗ ｙ ｏ ｉ ａｉａｉｎ ｉｔｒｅ ｔ ｎ ｏ Ｓ ｖａ ｏ ｓｒａｉｎ ｔｅ ｅ ｐｅ ｓ ｎ ｏ ｘ ３ ｔａ ｔ Ａｂ ｊｃｉｅ ｏ ｆ ｄ ｏ ｔｔｅ ｂ ｓ ａ ｆｖｔ ｆ ｔ ｎｅｖ ｎｉ ｆＦ Ｈ ｉ ｂ ｅｖ ｔ ｈ ｘ ｒｓｉ ｆＣ ４ ． ｉ ｒ ｃ ｏ ｏ ｏ ｏ
不同玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响
不同玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响郑轶;周平【摘要】Objective:To compare the effects of different vitrification carriers on the freezing human ovarian tissue,and provide the theoretical and experimental basis in selecting frozen solution. Methods:The human ovarian cortex tissues were cut into the size of 10 mmí1 mmí1mm,randomly divided into the fresh group(group A),needle immersed vitrification group(group B),solid surface vitrification group( group C) and direct covered vitrification group( group D) according to different vitrification carriers. The fresh group were fixed by 10% formaldehyde,embeded in paraffin,sectioned and stained with hematoxylin and eosin. The other three groups were preserved in liquid nitrogen after freezing for two months, then fixed, sectioned and stained using rapid rewarming protocol. The proportions of normal primordium follicles in group B,C and D were calculated by histological analysis,which was used to analyze the frozen effects. Results:There were 809 primordial follicles in four groups,the proportions of normal primordium follicles in group A,B, C and D were 96. 12%,88. 14%,80. 00% and 81. 25%,respectively. The proportions of normal primordium follicles in group B,C and D were lower than that in group A(P<0. 01),but the differences of which between group B,C and D were not statistically significant (P>0. 05).Conclusions:Compared with the fresh tissue,the proportions of normal primordium follicles decrease after freezing,but the vitrification freezingcan be used to preserve the human ovarian tissue still.%目的：：比较不同的玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响,为人卵巢组织玻璃化冷冻方案的选择提供理论基础和实验参考依据。
卵母细胞的冷冻技术
一、冷冻技术概述
2.细胞损伤假说
冷冻损伤是卵母细胞冷冻保存的主要障碍，有报 道认为冷冻常会使细胞膜，透明带发生变化，细胞骨 架被破坏，染色体出现异常等。
一、冷冻技术概述
1.2冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种
①渗透性冷冻保护剂主要有丙二醇（PROH）、二
甲基亚砜（DMSO)、甘油和乙二醇(EG)等。 渗透性冷冻保护剂主要通过细胞膜，降低溶液的冰 点，增加溶液的粘性，稀释溶液中的溶质浓度。
一、冷冻技术概述
②非渗透性冷冻保护剂主要有蔗糖、葡萄糖和脂蛋白等。
研究发现包裹卵母细胞的卵丘细胞层数越多，解冻 后卵母细胞存活率越高。Jack等比较冷冻GV期卵母细 胞前后变化，发现致密的COC与裸卵相比具有较高的成 熟率。可能是卵丘细胞参与了卵母细胞的成熟，如果去 除卵丘细胞，成熟率则会大幅度降低。
三、实验
⑴冷冻方法与保护剂对牛卵母细胞解冻后细胞 发育的影响
1.卵母细胞的采集与成熟培养
一、冷冻技术概述
随着生物学、医学和低温制冷技术的发展，低温冷冻 技术已逐渐形成的一门边缘学科低温生物学，该领域主 要应用是在保存各种细胞、组织、胚胎、器官甚至是活 体的冷冻保存。 在超低温条件下动物种质细胞之所以能长期保存，是 因为种质细胞内一切新陈代谢过程中的化学变化被超低 温所抑制，当温度降到一定限度时，细胞内所有的化学 变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存； 低温保存的细胞以一定的方式复苏后，又具有存活的能 力。
采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究
采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究目的比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响，寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。
方法将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组，包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。
观察各组卵巢组织卵泡形态；冻融后的卵巢组织行体外培养，比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。
结果冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组，差异有统计学意义（P0.05），TV组卵泡正常形态率最低（P0.05）。
2.3培养液中激素的测定结果体外培养的10d中，与新鲜培养液相比，复苏后卵巢组织培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随着培养时间逐渐升高（图3A、3B）。
SSV组雌二醇和孕酮平均浓度明显高于其他组（P0.05）。
3讨论玻璃化冷冻过程需要一个特殊的载体承载冷冻保护液和组织细胞，对于卵巢组织而言，载体需要一定的容积同时要尽量减少所需冷冻液的体积以提高降温速度。
此外，当组织被浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹在组织周围，由于其低导热性形成有效的绝热区从而减缓了降温速度[9]。
由此可见，载体的选择要考虑上述多种影响因素。
目前已有多种载体被实验性地应用于玻璃化冷冻过程，如冷冻管（cryovial）、开放式拉长麦管[10]、最小微滴法和不锈钢网筛等。
冷冻管被应用于卵巢组织的程序化冷冻，但因管壁较厚和所需较多冷冻液，导致降温速度慢，不能满足玻璃化形成的需要。
在本研究中，冷冻管玻璃化组的正常形态原始卵泡仅为64.57%，冻存效果显著低于其他组。
Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷冻猴子的卵巢组织，复温后约70.4%的卵泡保存正常形态。
本研究中也使用了该方法玻璃化冷冻人卵巢组织，复温后形态学检测可见约78.36%的原始卵泡保存了正常形态，低于新鲜组和SSV组；体外培养后，生长卵泡比例增加，但仍低于新鲜组和SSV组，提示直接微滴玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态及发育潜能存在一定影响。
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析
冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响分析冷冻保存技术（Cryopreservation）对细胞存活率和功能恢复具有重要的影响。
在很多领域，包括医学研究，生物技术和生殖医学中，需要长期保存细胞样本或组织。
冷冻保存技术可以延长细胞的保存时间，但同时会对细胞造成一定程度的损伤。
本文将对冷冻保存技术对细胞存活率和功能恢复的影响进行分析。
首先，冷冻保存技术对细胞存活率的影响是关键的。
当细胞被冷冻保存时，细胞内的水分会在冷冻过程中形成冰晶，这可能导致细胞脱水和细胞器的破坏。
为了尽量减少这些损伤，科学家们已经开发了各种冷冻保护剂，如甘油和二甲亚砜（DMSO），用于保护细胞免受冻结所引起的细胞脱水和冰晶形成。
这些保护剂可以在冷冻过程中起到稳定细胞膜和细胞内结构的作用，从而提高细胞的存活率。
此外，科学家们还不断改进冷冻的速度和方法，例如快速冷冻（快速冷却）和慢速冷冻，以进一步提高细胞存活率。
其次，冷冻保存技术对细胞的功能恢复也有影响。
在冷冻过程中，细胞内部的生物化学反应速度大大降低，细胞代谢活动几乎停止。
这可能导致细胞内重要蛋白质、酶和其他生物分子的结构和功能发生改变，使细胞在解冻后难以正常运作。
此外，冷冻保存过程中的细胞脱水和冰晶形成也可能导致细胞器的破坏，进一步影响细胞的功能。
然而，通过合适的解冻过程和适当的培养条件，可以促进冷冻保存后细胞的功能恢复。
例如，逐渐将细胞从低温解冻到正常温度，并提供适当的培养基和营养物质，有助于细胞逐渐恢复其正常的代谢活动和功能。
此外，不同类型的细胞对冷冻保存技术的影响可能有所不同。
某些类型的细胞，如干细胞和胚胎细胞，对冷冻保存更为敏感。
冷冻保存过程中可能导致干细胞或胚胎细胞的分化能力下降，细胞的干细胞特性丧失。
因此，在冷冻保存这些类型的细胞时，需要更加精细的处理和保护措施，以确保其存活率和功能的恢复。
另外，冷冻保存技术在不同研究领域和应用中也有一些局限性。
有些细胞或组织不适合冷冻保存，因为其细胞膜不耐受冷冻过程所引起的损伤。
冷冻保存中的细胞稳定性研究
冷冻保存中的细胞稳定性研究在现代科技的支持下，冷冻保存成为了常见的生物标本保存方式。
通过将细胞、组织或器官在低温下保存起来，可以有效延长其保存时间，并为后续研究提供基础材料。
然而在冷冻过程中，细胞的稳定性成为了一个重要的问题。
本文将从细胞稳定性研究的角度探讨冷冻保存中的细胞稳定性问题。
1. 冷冻过程对细胞的影响在冷冻时，细胞内的水分会结晶成为冰，产生机械损伤，导致细胞膜和细胞器的受损。
此外，冷冻导致细胞内外的渗透压不平衡，进而影响代谢和生理状态。
所有这些因素都会影响到细胞的稳定性。
2. 细胞的适应性细胞自身具有一定的适应性，可以通过调整某些生理机制以适应环境变化。
在冷冻过程中，部分细胞可以通过调整膜脂类的合成和结构，增强细胞膜对冰晶的抵抗力。
此外，细胞可以通过合成耐寒蛋白（cold shock protein）等保护性蛋白，来抵御低温对细胞的影响。
3. 冷冻保护剂（Cryoprotectant）为了增强细胞的抗冻能力，在冷冻保存过程中，通常需要加入一定量的冷冻保护剂。
冷冻保护剂可以降低细胞内外溶液的结晶点，避免形成大的冰晶，从而减少对细胞的机械损伤。
同时，冷冻保护剂还可以控制细胞内外的渗透压，抑制细胞膜的破坏。
目前常用的冷冻保护剂包括甘油、DMSO和乙二醇等。
4. 冷冻保存中的细胞稳定性研究冷冻保存中的细胞稳定性研究是一个涉及多个学科的综合性课题。
现代科研中，可以通过多种手段来评估细胞的稳定性，如细胞存活率、细胞形态、细胞功能特性以及基因表达等指标。
其中，常用的细胞存活率评估方法包括荧光活细胞显微镜、细胞计数器和MTT法等。
细胞形态和功能特性的评估则可以通过扫描电镜、荧光染色和酶标法等方式进行。
基因表达分析则可以通过基因芯片等高通量技术进行。
5. 细胞稳定性的影响因素除了冷冻过程和冷冻保护剂之外，还有多种因素会影响细胞的稳定性。
如细胞的种类和来源、冷冻存放时间和温度等。
一些细胞（如神经元和心肌细胞等）对低温敏感，容易受到冰冻和解冻的影响。
低温冷冻小鼠实验报告
实验名称：低温冷冻对小鼠细胞存活率及生物学功能的影响实验目的：探讨低温冷冻对小鼠细胞存活率及生物学功能的影响，为低温冷冻技术在生物医学领域的应用提供理论依据。
实验材料：1. 实验动物：健康雄性小鼠，体重20-25g，共20只。
2. 低温冷冻设备：低温冰箱、冷冻箱、超低温冰箱等。
3. 实验试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、细胞计数试剂盒等。
4. 仪器：倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
实验方法：1. 实验分组：将20只小鼠随机分为两组，每组10只，分别为冷冻组与对照组。
2. 低温冷冻处理：冷冻组小鼠置于低温冰箱中，冷冻温度设置为-80℃，冷冻时间为24小时。
3. 对照组小鼠在相同条件下放置，但不进行冷冻处理。
4. 冷冻复温：将冷冻组小鼠从低温冰箱中取出，置于37℃水浴中复温30分钟。
5. 细胞培养：将冷冻组与对照组小鼠的肝脏、肾脏、心脏等组织分别剪碎，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。
6. 细胞存活率检测：采用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡情况，通过流式细胞仪分析细胞凋亡率。
7. 生物学功能检测：通过酶标仪检测细胞增殖情况，通过倒置显微镜观察细胞形态变化。
实验结果：1. 冷冻组小鼠细胞凋亡率显著高于对照组（P<0.05），表明低温冷冻对小鼠细胞具有一定的损伤作用。
2. 冷冻组小鼠细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05），表明低温冷冻对小鼠细胞生物学功能具有一定的抑制作用。
3. 冷冻组小鼠细胞形态发生明显变化，出现细胞肿胀、皱缩等现象，与对照组相比差异显著（P<0.05）。
实验结论：1. 低温冷冻对小鼠细胞具有一定的损伤作用，导致细胞凋亡率增加、增殖能力下降。
2. 低温冷冻对小鼠细胞生物学功能具有一定的抑制作用，表现为细胞形态发生改变。
3. 本实验为低温冷冻技术在生物医学领域的应用提供了理论依据，为低温冷冻保存细胞和组织提供了参考。
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
➢ 冷冻过程
快速冷冻法
由室温开始以1℃/min的速度降至-5~-7℃诱发结晶，在此 温度下平衡10min℃，然后以0.3℃/min的速度降至30℃~40℃，投入液氮保存。
一步冷冻法
牛和山羊目前仍处于试验阶段
牛7日龄囊胚可在2.1mol/L甘油、0.25mol/L蔗糖混合液中 室温下脱水2min，将装有胚胎的细管垂直放在液氮罐颈部 5min，结晶后投入液氮。
非渗透性保护剂
这是一类大分子化合物，能溶于 水，性 保护剂促使细胞脱水，减少细 胞内冰晶形成；组成玻璃化液 时，可有效降低渗透性保护剂 的分子浓度、可使发生玻璃化 的相变温度升高、可促进胞质 及保护液玻璃化；解冻时，为 卵母细胞和胚胎提供一个高渗 环境，避免水分进入胞内过快 而产生的渗透性破裂。
冷冻方法
一、卵母细胞的冷冻 保存
➢ 卵母细胞的获得 活体卵巢采卵 屠宰动物卵巢采卵
1.抽吸法 2.切割法 3.剥离法 刀片切割卵巢可采取卵巢 内部卵泡
➢ 卵母细胞的分级与筛选 牛的卵母细胞可分为以下几个等级：
1. A级：外周有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞 质均匀并充满于透明带内。
2. B级：外周有1~3层卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀。 3. C级：卵丘细胞扩散，卵母细胞胞质不均匀。 4. D级：无卵丘细胞的裸卵，细胞质不均匀，且有
➢ 细胞的冷冻保存并不在于能 否长期耐受低温，而是在于 冷冻和解冻时对细胞的致死 性作用（致死性温区-50~15℃）
一、胚胎和卵母细胞在低温冷冻保存过程中 的受损机制
➢ 在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与 溶质分离，使细胞外液浓度升高、渗透压增加，细胞内水 分渗出产生溶液效应。
➢ 随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的 溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。这时可能发生 两种情况：
冷冻保存对卵母细胞影响的研究进展
振光 显微镜 观察 到 ，经传统 的慢速 冷冻方 法冷 冻的
卵母 细胞在 融解 过程 中纺锤体 消失 ， 虽多数 可在 ３ｈ
生 的婴儿 仅三百 多例 。卵母 细胞体 积大 只是造成 卵
母 细胞 冷冻 困难 的重要 原 因之 一 。而 在冷 冻 、 冻 解
山 东省计 划 生育科研 所 生殖 医学中心 （５ ０ ２ 董 云玲 刘永 洁 ２００ ） 综述 李 娟 审校
摘 要 随着 辅 助 生殖 技 术 的发 展 ， 卵母 细胞 的冷 冻 技 术受 到 了广 泛 关 注并 被 广 泛 应用 。但 与 早 期 胚胎 的冷 人
冻保存相比 ， 卵母 细胞 的冷 冻 保 存具 有 复 苏 后 成活 率 低 、 精 率 低 、 胎 发 育 潜力 差 、 受 胚 妊娠 率 低 、 产 率 高 等 特 点 。冷 流 冻 和解 冻 过 程 以及 冷 冻 保 护 剂等 均 会 对 卵母 细胞 造 成 一 系 列形 态 学 、 细胞 学 以及 生理 、 化方 面 的 影 响 。 如 ： 冻 保 生 冷 护剂 、 冻融 过 程 等 可 对 卵母 细 胞 的 纺锤 体 、 细胞 骨 架 、 胞 内钙 离 子 、 白质组 、 胞代 谢 以及 卵母 细 胞 的活 性 和 发 育 细 蛋 细 潜 力 造 成 不 同 程度 的影 响 。研 究 卵 母 细 胞特 殊 的生 物 学特 性 以及 冷 冻 对其 造 成 的 影 响 ， 助 于 改进 卵 母 细 胞 的 冷 冻 有
冻存 以避 免卵子 浪费 。该项 技术还 可为 卵子赠送 提 供方 便 。 自 １８ ９ ６年 Ｃ ｅ ｈ ｎ等首次报 道冻融 人卵母 细 胞 获成 功妊 娠 已二 十余 年 ，这 项技 术 进展 缓慢 ， 出
胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术
在使用冷冻保护剂时，需要严格控制浓度和暴露时间，以避免对细胞造 成毒性和其他不良影响。
冷冻和融化过程
冷冻过程是在极低温度下将胚胎或卵母 细胞快速冷却到玻璃态的过程。在这个 过程中，细胞内的水分子被固定在玻璃 态中，形成一种类似玻璃的结构，从而
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温度变化引起的渗透压变化
在冷冻和复苏过程中，温度的快速变 化可能引起细胞内外的渗透压变化， 导致细胞损伤。
前景展望
新型冷冻保护剂的开发
随着科学技术的发展，新型的、对细胞毒性更小的冷冻保 护剂正在被不断开发出来，这将有助于提高细胞的存活率 和功能。
3D打印技术的结合
3D打印技术可以用于制造具有复杂结构的生物材料，这 些生物材料可以用于模拟细胞生长的三维环境，提高细胞 的存活率和功能。
• 步骤：玻璃化冷冻法包括预处理、玻璃化、解玻璃化和复苏等步骤。预处理阶 段与慢速冷冻法相似；玻璃化阶段会快速将细胞降至-196°C；解玻璃化阶段会 快速升温至适宜温度；复苏阶段同样进行恢复培养。
• 优点：玻璃化冷冻法降温速度快，避免了冰晶形成对细胞的损伤，因此能够提 高胚胎及卵母细胞的存活率。
• 缺点：玻璃化冷冻法操作难度较大，需要使用特殊的设备和试剂，成本较高， 且仍存在一定的细胞损伤和突变风险。
卵母细胞冷冻保存
总结词
卵母细胞冷冻保存技术是一种新兴的生 殖技术，通过低温保存卵母细胞，延长 其存活时间，为女性生育力的保存提供 了可能。
VS
详细描述
随着辅助生殖技术的发展，越来越多的女 性选择通过卵母细胞冷冻保存技术来保存 自己的生育力。这种技术通过将卵母细胞 置于低温下，使其进入休眠状态，以便在 未来需要时进行复苏和受精。这种技术为 女性提供了更多的生育选择和机会，尤其 适用于那些需要进行化疗等治疗的女性患 者。
小鼠卵母细胞冷冻保存技术研究进展
细胞能体外成熟 ， 但体外受精后仅 ９ ～１． ％发 状 态 ， ７３ 细胞将 不会 受到 损伤 。
． 育 到两 细胞 。１９ ９４年 ， 低 温冷 冻 保 存 小 鼠 Ｇ 期 １ ２ 解 冻对 细胞 的作 用 超 Ｖ
卵母 细胞 的研 究 取 得 了突 破 ， 获得 了后 代 。本 文 并
０ 剩 ０ 鼠卵母 细胞 ， 体外 受精 胚胎 移植 后产 仔率 达４ ． 。 温 度之 前失 去 ９ 的水分 ， 下 １ 的边界水 的结 ５８
与成熟 卵母 细胞 相 比， 成 熟 卵母 细 胞 的冷冻 更 为 冰 机率 可忽 略不 计 。冷 冻 过 程 中 ， 未 细胞 内形 成冰 晶 其关 键 是 冰 晶 的 大小 。 只要 不形 成 困难 。１ ９ 年 ， ｃｒｅｅ 等用不 同方法冷冻保存 是 不 可避免 的 ， ９０ Ｓ ｈｏｄ ｒ 而是维持在微 晶 小 鼠生发泡 期 （ ＧＶ） 的卵母 细胞 ， 冻后 大部分 卵母 对细胞造成物理性损害 的大冰晶， 解
解 冻速度 取 决 于冷 却 时 细 胞 内水 分 的含 量Ｌ 。 ６ ］
０ － ０℃之 间终 止 ， 细胞 将 从小 鼠卵母细 胞 的保 存 原 理 、 冻 保 护 剂 的作 用 如 果细 胞慢 速冷却 至 一３ ～－４ 冷 解 避免小 冰 机 理 、 冻方 法 的原 理及 卵母 细 胞 冷 冻保 存 方 法 等 内形 成一 定量 的冰 晶 ， 冻速度 必须 较快 ， 冷
起来 的另一项很有潜力 的繁殖技术Ｌ ， １ 能够为体外 内向细胞外渗透 ， ］ 并继续在细胞外结冰 ； 如果细胞被 受精 、 核移植 、 转基因动物研制等胚胎工程技术提供 冷却过慢 ， 大量水分由细胞 内流向细胞外 ， 降低了细
更方 便和 更多 的材料 来 源 。小 鼠是 现 阶段最 主要 的 胞 膜 内外 的化学 势能 ， 造成 细胞 内进行性 脱水 ， 因此 实验 动物 ， 对其 卵母 细胞 冷冻 保存 的研 究 开 始 于 ２ 细胞 内不 可能形 成 冰 晶。相 反 ， 果 细胞 被 冷却 得 ０ 如 世纪 ５ ０年代 ［ 。１７ 年 ， ｉｉｇ ａ 。首 次报 道 过 快 ， ９ ７ Ｗｈｔ ｎ ｈｍ［ ｔ ］ 细胞 内的水 分不 能及 时流 出 ， 达不 到细胞 内外
小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较
存小 鼠卵母细胞妊娠成功并产仔 以来 ， 研究者对 卵子冷冻进
行了大量的研究 ， 借鉴胚胎 冷冻技术 。１８ 年 Ｃｅ 等 大都 ９６ ｈｎ
采用慢冻 一 快融法 （ 程序化法） 冷冻人卵子成 功妊娠 ， 之后也
有学者用与 Ｃｅ 类似 的慢 冻法妊 娠分娩 的报道 ， ｈｎ 但妊 娠率
太低 ， 冷冻的效果 一直不理想 。１８ ９ ９年 Ｎ ｋｇｔ【 在 Ｒ ｌ的 ａａａ Ｉ ａ ａ ｌ
和培养 ｌ 组的 ， ｈ 受精率 、 卵裂率。 两组 比较， 均有显著性差异 （ ＜ ． ５ 。结论 Ｐ ００ ）
本实验证实 ， Ｐ Ｏ Ｓ玻璃化冷冻法至
少可以达到程序化冷冻法 同样的效果， Ｏ Ｓ 而 Ｐ 玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法 的趋势。加之 ， 其简便 、 省时 、 经济
等优点 ， 因而 ， 更有发展前景。 【 关键词】 小鼠卵母细胞 ； 程序化冷冻； Ｏ Ｓ Ｐ 玻璃化冷冻
控光（４ｈ １ 光照 ， １ ｈ黑暗 ） 养 １ ， 连医科大学 实验 ０ 饲 周 由大
动物中心提供 。 １２ 主要试剂 ． 尿促性素 、 绒促性素（ 宁波人健药 业有限公 司 ） 乙二醇 （ Ｇ 、 ， Ｅ ） 丙二醇 （ Ｒ Ｈ） 透明质酸酶 （ 国 Ｓｇ ａ ＰＯ 、 美 ｉ ｍ 公司） 蔗糖 （ ） 纯度 ９ ． ％ ， 国 Ａ ｒｓｏ公 司 ） Ｈ Ｐ Ｓ ， Ｓ（ ９９ 美 ｍ ｅｃ ，ＥＥ 液 、Ｔ Ｈ Ｆ液、 血清、 培养用油 （ 国 Ｑ ｉｎ 公司） 美 ｕｎ’ ｓ 。 １３ 主要溶 液的 配制 （ ） 础液 ：０ 小 牛血清 ＋ Ｈ Ｆ ． １基 １％ Ｔ
（ ） Ｐ 玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率 、 １Ｏ Ｓ 受精率 、 卵裂率及 ６ ８ｅ 胚形成率均 — ｃｌ ｌ
卵母细胞冷冻保存的方法
卵母细胞冷冻保存的方法（一）卵母细胞的获取随着哺乳动物胚胎操作技术的成熟和胚胎移植技术商业化的迅猛发展，各领域对卵母细胞的需求量与日俱增。
单纯依赖超数排卵获取卵母细胞的方法费用高、对动物生理功能影响大且获得的数量有限，因此不能满足科学研究和生产的需求。
现在主要有两种获取卵母细胞的途径：一是从活体卵巢采集，二是从屠宰厂废弃卵巢中获取卵母细胞。
1.活体卵巢上采集（1）腹腔镜法：此法在手术部先行局部麻醉，以消毒导管针刺入腹腔并向腹腔内轻轻打气、压迫胃肠前移，从导管内插入内镜进行搜索观察。
另用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针在内镜引导下刺入卵泡内吸取卵母细胞。
该法在牛上采集排卵前卵母细胞可达80%～90%回收率。
（2）B型超声波法：此法将带有超声波探头和采卵针的采卵器插入到保定和麻醉母畜阴道子宫颈的一侧弯隆处缓慢移动卵巢，用吸卵针刺入直径大于2mm的卵泡，真空吸入卵母细胞和卵泡液。
现在，此法已成为牛活体采卵的主要方法。
（3）活体输卵管采卵法：通过手术方法采集排入输卵管内的卵母细胞。
打开腹部后，找到子宫角和输卵管并牵出腹腔外，自宫管接合部插入注射针、逆向从伞部输卵管腹腔孔冲洗，或者在宫管接合部子宫角尖下1cm处插入接卵管接于平皿中，自伞部输卵管腹腔口顺向注入冲卵液。
该方法目前是猪、绵羊、山羊、兔等动物常用的活体采卵方法。
2.屠宰后卵巢上采集动物屠宰后立即无菌采集卵巢，放入30～39℃灭菌生理盐水或灭菌PBS中，6小时内带回实验室。
尽管有人认为在18～21℃收集和操作牛卵母细胞能提高卵母细胞成熟率，Yang等（1990）的研究结果表明，牛卵巢在24℃保存24小时后收集的卵母细胞体外受精后仍有71.2%的卵裂率，而Solano等1994年的研究更显示将牛卵巢在4℃放置12～24小时后其卵裂率不受任何影响。
卵巢表面卵泡卵母细胞的获得是目前体外成熟培养中卵母细胞的主要来源，其采集方法有如下3种。
（1）抽吸法：用配以16号或18号针头的5ml或10ml注射器从直径2～6mm的卵泡中抽吸卵泡液。
不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻存和复苏的影响
不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冻 存和复苏的影响( 1. 广东广州 510631；2. 华南师范大学生命科学学院 2011 级生物科学 2 班)摘要： 以小鼠胎儿的成纤维细胞为实验材料 , 以不同冷冻保护剂（ 10%DMSO 、 10%EG 、 10%GL 、 5%DMSO+5%EG、5%DMSO+5%GL）和不同浓度的血清（10%、20%、30%）组合,冻存和复苏小鼠胎儿成 纤维细胞,观察贴壁情况和测定细胞存活率,以研究不同冷冻保护液对小鼠胎儿成纤维冻存和复苏. 实验结果表明:①同一冷冻保护剂剂对细胞的冷冻保护效果随着血清浓度的增加而增强（10%GL 除 外）;②5%DMSO+5%EG+30%FCS 的冷冻保护效果最好. 关键词：冷冻保护剂；血清浓度；冷冻保存；成纤维细胞；生理特性1 引言成纤维细胞具有较强的分裂增生能力， 适应性强且性状稳定， 是研究动物克隆最常用的 细胞类型。
对于 ES 细胞的分离和克隆而言,成纤维细胞冷冻保存能随时提供饲养层而不受胎 ［ ］ 儿、睾丸或其它实验材料不足的限制 1 。
但是，体外培养的细胞，随着传代次数的增加， 细胞各种生物学特征会逐渐发生变化，同时，长期传代也会造成资源浪费。
细胞冷冻在超低 温(-196℃)环境之下,其代谢活动几乎停止,解冻复苏之后又能恢复正常的生理活动。
因此， 在 细胞传代过程中，需要适时进行细胞冷冻保存，以保证体外培养细胞的质量，又便于取用。
细胞若在不加低温保护剂而直接进行冻存， 细胞内外环境中的水会形成冰晶， 导致细胞 发生一系列的变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH 改变、蛋白质变性 等等，最终导致死亡。
因此需要使用合适的细胞冷冻保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受 冰晶破坏。
常用的冷冻保护剂主要包括二甲亚砜（DMSO） 、乙二醇（EG） 、甘油（GL )。
使用不同冷冻保护剂， 冻存和复苏效果存在差异， 因此探究不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤 维细胞冻存和复苏的影响，以便于更好保存细胞，具有重大意义。
小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻研究
华中科技大学硕士学位论文小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：***20060401华中科技大学同济医学院硕：Ｉｊ毕业论文．附图图１Ａ小鼠新鲜卵巢组织切片（×４００）图１Ｂ实验组Ｉ复苏后的组织切片（×４００）图１ｃ实验组ＩＩ复苏后的组织切片（×４００）图１Ｄ实验组Ⅲ复苏后的组织切片（×４００）图２玻璃化冷冻复苏后小鼠卵巢组织的电泳结果图５玻璃化冷冻复苏后的卵巢组织中始基卵泡透射电镜照片ｘ１００００２０华中科技大学同济医学院硕士毕业论文图４卵巢组织暴露于不同玻璃化冷冻溶液卵母细胞的存活率比较图６Ａ分离玻璃化冷冻复苏的卵巢组织所得图６Ｂ玻璃化冻融卵巢组织分离出的窦前卵泡４００ｘ０ＧＣ２００ｘ华中科投大学同济医学院顾：Ｉ‘毕业论文图３ＰＩ染色示死细胞幽８Ａ幽８Ｃ图８Ｅ幽７ＭＩＩ期卵母细胞纺锤体荧光染色镜检结果幽８Ｂ图８Ｄ图８Ｆ小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻研究作者：陈薪学位授予单位：华中科技大学1.Meirow D.Nugent D The effects of radiotherapy and chemothrapy on female reproduction 20012.Blatt J Pregnancy outcome in long-term survivors of childhood canceer 19993.Abir R.Fisch B.Nitke S.Okon,E, Raz,A. 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激光扫描共聚焦显微镜观察水稻双受精过程[期刊论文]-河南农业科学2007(6)3.马云涛应用激光共聚焦显微镜技术对脑脊液脑膜癌细胞内质网、线粒体的相关研究[学位论文]2010引用本文格式：陈薪小鼠卵巢组织的玻璃化冷冻研究[学位论文]硕士 2006——附加文档一篇，不需要的朋友下载后可以编辑删除，谢谢——工程概况刘家湾北段市政工程总长度545m；道路设计红线宽度主线30m,一副路面；车行道16m;绿化带2*4m；人行道2 *3m。
卵母细胞和卵巢组织的冷冻
卵母细胞和卵巢组织的冷冻
陈荪红;吴明章
【期刊名称】《生殖医学杂志》
【年(卷),期】2001(010)006
【摘要】@@ 精子冻存已取得了一定的成功,但是冻存的卵母细胞体外发育的成功率很低,因为卵母细胞冻存与许多因素有关,成熟的卵母细胞对冻存非常敏感,很容易出现非整倍体现象.为了提高卵母细胞的受精率,人们已着手研究不成熟卵母细胞及卵巢的冻存.要建立一个方法,使生长完全的生殖泡(germinal vesicle,GV)和MII卵母细胞暴露于与冻存有关的物理和化学逆境后,仍然具有很高的存活率、受精率和发育率.目前还没有一个简单可行的冻存方法,而且主要困难在于如何使原始卵泡中的未成熟卵母细胞发育为成熟的卵母细胞.
【总页数】5页(P374-378)
【作者】陈荪红;吴明章
【作者单位】上海第二医科大学组胚教研室,上海,200025;上海第二医科大学组胚教研室,上海,200025
【正文语种】中文
【中图分类】R33
【相关文献】
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4.应用自研载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻保存羊卵巢组织的效果比较 [J], 崔妍婷;杨璐恺;刘金;韩亦龙;陈超;邓晓惠;蒋利刚
5.玻璃化冷冻和程序化冷冻人卵巢组织的效果 [J], 刘艳丽;申峻涵;杜姗姗;刘景;申春艳;肖小帅;管一春
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